Strip-basierte Immunoassays
Schlüsselpunkte
- Einfache Anwendung
- Ergebnisse können innerhalb von 15 Minuten vorliegen
- Geringe Kosten ohne zusätzliche Ausrüstung
- Stabil und robust in der Lagerung
Die
Während Schnellmethoden in den letzten zwanzig Jahren einen großen Einfluss auf mikrobiologische Tests hatten, nur eine Handvoll Entwicklungen kann von sich behaupten, dass sie das Testen aus dem Labor herausgenommen haben. Eine davon ist der Lateral-Flow-Immunoassay-Test, auch bekannt als immunchromatographischer Assay oder Streifentest, der infolgedessen weit verbreitet ist. Wie viele der besten Ideen basieren auch die Lateral-Flow-Immunoassays auf einer ausgeklügelten und hochentwickelten Technologie, die so einfach zu handhaben ist, dass sie von fast jedem verwendet werden kann.
Die Technologie Die grundlegende Technologie, die den Lateral-Flow-Immunoassays zugrunde liegt, wurde erstmals in den 60er Jahren beschrieben, aber die erste kommerzielle Anwendung war der Clearview-Schwangerschaftstest von Unipath, der 1988 auf den Markt kam. Seitdem wurde dieselbe Technologie zur Entwicklung einer breiten und ständig wachsenden Palette von Tests für klinische, veterinärmedizinische, landwirtschaftliche, lebensmittelindustrielle, biologische Verteidigungs- und Umweltanwendungen eingesetzt.
Strip-Tests sind äußerst vielseitig und für eine enorme Bandbreite von Analyten erhältlich, von Blutproteinen bis zu Mykotoxinen und von viralen Krankheitserregern bis zu bakteriellen Toxinen. Es wurde sogar ein Test für Weinproduzenten entwickelt, um das Ausmaß der Botrytisfäule in frisch geernteten Trauben zu bestimmen.
Laterale Durchfluss-Immunoassays sind im Wesentlichen Immunoassays, die so angepasst sind, dass sie entlang einer einzigen Achse arbeiten, um dem Teststreifenformat zu entsprechen. Eine Reihe von Variationen der Technologie wurden zu kommerziellen Produkten entwickelt, aber sie arbeiten alle nach dem gleichen Grundprinzip.
Wie funktioniert ein immunchromatographischer Lateral Flow Assay?
Ein typischer Teststreifen besteht aus den folgenden Komponenten:
- Probenkissen – ein saugfähiges Kissen, auf das die Testprobe aufgetragen wird
- Konjugat- oder Reagenzkissen – dieses enthält Antikörper, die für den Zielanalyten spezifisch sind und mit farbigen Partikeln konjugiert sind (normalerweise kolloidale Goldpartikel, oder Latex-Mikrokügelchen)
- Reaktionsmembran – in der Regel eine hydrophobe Nitrocellulose- oder Celluloseacetatmembran, auf der Antikörper gegen den Zielanalyten in einer Linie quer über die Membran als Fängerzone oder Testlinie immobilisiert sind (eine Kontrollzone kann ebenfalls vorhanden sein, (eine Kontrollzone kann auch Antikörper enthalten, die für die Konjugat-Antikörper spezifisch sind)
- Docht oder Abfallbehälter – ein weiteres absorbierendes Kissen, das dazu bestimmt ist, die Probe durch Kapillarwirkung über die Reaktionsmembran zu ziehen und sie aufzufangen
Die Bestandteile des Streifens sind in der Regel an einem inerten Trägermaterial befestigt und können in einem einfachen Peilstabformat oder in einem Kunststoffgehäuse mit einer Probenöffnung und einem Reaktionsfenster, das die Fang- und Kontrollzonen zeigt, präsentiert werden.
Es gibt zwei Haupttypen von Lateral-Flow-Immunoassays, die bei mikrobiologischen Tests verwendet werden:
Doppelantikörper-Sandwich-Assays Bei diesem Format wandert die Probe vom Probenpad durch das Konjugatpad, wo sich der vorhandene Zielanalyt an das Konjugat bindet. Die Probe wandert dann weiter durch die Membran, bis sie die Capture-Zone erreicht, in der der Target/Konjugat-Komplex an die immobilisierten Antikörper bindet und eine sichtbare Linie auf der Membran erzeugt. Die Probe wandert dann weiter entlang des Streifens, bis sie die Kontrollzone erreicht, wo überschüssiges Konjugat bindet und eine zweite sichtbare Linie auf der Membran erzeugt. Diese Kontrolllinie zeigt an, dass die Probe wie vorgesehen durch die Membran gewandert ist. Zwei klare Linien auf der Membran bedeuten ein positives Ergebnis. Eine einzelne Linie in der Kontrollzone ist ein negatives Ergebnis. Doppelantikörper-Sandwich-Assays eignen sich am besten für größere Analyten wie bakterielle Krankheitserreger und Viren mit mehreren Antigenstellen.
Kompetitive Assays Kompetitive Assays werden in erster Linie zum Testen kleiner Moleküle verwendet und unterscheiden sich vom Doppelantikörper-Sandwich-Format dadurch, dass das Konjugat-Pad Antikörper enthält, die bereits an den Zielanalyten oder an ein Analogon davon gebunden sind. Wenn der Zielanalyt in der Probe vorhanden ist, bindet er daher nicht an das Konjugat und bleibt unmarkiert. Wenn die Probe entlang der Membran wandert und die Einfangzone erreicht, bindet ein Überschuss an unmarkiertem Analyt an die immobilisierten Antikörper und blockiert den Einfang des Konjugats, so dass keine sichtbare Linie entsteht. Das ungebundene Konjugat bindet dann an die Antikörper in der Kontrollzone, wodurch eine sichtbare Kontrolllinie entsteht. Eine einzelne Kontrolllinie auf der Membran ist ein positives Ergebnis. Zwei sichtbare Linien in der Fänger- und der Kontrollzone bedeuten ein negatives Ergebnis. Ist jedoch kein Überschuss an unmarkiertem Zielanalyten vorhanden, kann in der Fängerzone eine schwache Linie entstehen, die ein nicht eindeutiges Ergebnis anzeigt. Kompetitive Assays eignen sich am besten für Tests auf kleine Moleküle, wie z. B. Mykotoxine, die nicht an mehr als einen Antikörper gleichzeitig binden können. Es gibt eine Reihe von Variationen der Lateral-Flow-Technologie. Die Fängerzone auf der Membran kann anstelle von Antikörpern immobilisierte Antigene oder Enzyme – je nach Zielanalyt – enthalten. Es ist auch möglich, mehrere Fängerzonen einzusetzen, um einen Multiplex-Test zu erstellen. So wurden beispielsweise kommerzielle Teststreifen entwickelt, die die beiden EHEC-Shiga-Toxine ST1 und ST2 in derselben Probe getrennt nachweisen können.
Lateral-Flow-Immunoassays sind auch von ungeschulten Anwendern einfach zu bedienen und liefern im Allgemeinen innerhalb von 15 Minuten ein Ergebnis. Sie sind sehr stabil und robust, haben eine lange Haltbarkeit und müssen normalerweise nicht gekühlt werden. Außerdem sind sie relativ kostengünstig in der Herstellung. Aufgrund dieser Eigenschaften eignen sie sich ideal für den Einsatz am Point-of-Care und für die Untersuchung von Proben im Feld sowie im Labor. Ihre Empfindlichkeit ist jedoch ohne zusätzliche Konzentrations- oder Kulturverfahren begrenzt.
Quantitative Tests Während die meisten Lateral-Flow-Immunoassays nur ein qualitatives Ergebnis liefern können, ist es möglich, ein gewisses Maß an Quantifizierung zu erhalten, indem die Menge des an die Fängerzone gebundenen Konjugats gemessen wird. Dies kann mit einem speziellen Lesegerät erfolgen, das die Intensität der farbigen Testlinie misst. Die Neogen Corporation hat beispielsweise das Accuscan™-Lateral-Flow-Lesegerät für die Verwendung mit ihren Reveal®-Testkits entwickelt, und auch Charm Sciences bietet ein Lesegerät für ihre Rosa®-Reihe von Mykotoxin-Teststreifen an. Es wurden auch anspruchsvollere Techniken entwickelt, wie z. B. mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Konjugate, um das quantitative Potenzial von Lateral Flow Assays zu verbessern. Anwendungen In den 20 Jahren seit der Markteinführung des ersten Lateral-Flow-Tests wurde eine Vielzahl verschiedener Tests auf der Grundlage derselben Technologie entwickelt. Die ersten kommerziell erhältlichen Kits waren für den Bereich der klinischen Diagnostik bestimmt, aber inzwischen gibt es Produkte, die in fast allen Bereichen der Mikrobiologie Anwendung finden.
Klinische Mikrobiologie – Lateral-Flow-Tests wurden für bakterielle Krankheitserreger, respiratorische und enterische Viren, Darmparasiten und bakterielle Toxine entwickelt. Viele der für den klinischen Bereich konzipierten Lateral-Flow-Immunoassays sind für die direkte Untersuchung von Fäkalien-, Blut- und Urinproben sowie Nasen- und Rachenabstrichen am Point-of-Care bestimmt, wo die einfache Handhabung und Schnelligkeit der Tests der Schlüssel zu ihrer Verwendung außerhalb des Labors ist. Dieselben Teststreifen können jedoch auch als schneller Bestätigungstest nach einer Laborkultur klinischer Proben nützlich sein.
Lebensmittel- und Agrarmikrobiologie – Teststreifen sind für bakterielle Krankheitserreger in Lebensmitteln sowie für bakterielle und pilzliche Toxine erhältlich. Im Bereich der Lebensmittelmikrobiologie sind die Hauptanwendungen eher im Labor zu finden, obwohl es auch Feldtestkits für Mykotoxine in Getreideproben gibt. Der Test auf bakterielle Krankheitserreger in Lebensmitteln umfasst im Allgemeinen mindestens eine Anreicherungsstufe, bevor der Teststreifen zur Bestätigung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins des Erregers verwendet wird. Einige Hersteller, wie z. B. Hygiena, haben Anreicherungsmedien und -methoden entwickelt, die speziell für die Verwendung mit Lateral-Flow-Teststreifen ausgelegt sind. Teststreifen können auch für die schnelle Bestätigung der Identität von Bakterienisolaten aus konventionellen mikrobiologischen Tests nützlich sein.
Wasser- und Umweltmikrobiologie – begrenzte Anzahl von Assays verfügbar.
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