Virus und Zellen
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Experimente mit einem klinischen Influenzavirus-Isolat in MDCK-Zellen A/Memphis/14/96-M (H1N1) durchgeführt, das freundlicherweise von Dr. Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, USA) zur Verfügung gestellt wurde. Die in Abb. 5 beschriebenen Viren wurden freundlicherweise von den in den Danksagungen aufgeführten Kollegen zur Verfügung gestellt.
MDCK-Zellen und MDCK-SIAT1-Zellen, die mit 2,6-Sialyltransferase zur verstärkten Expression von Neu5Ac2-6Gal-terminierten Oligosacchariden stabil transfiziert wurden, wurden bereits zuvor beschrieben. Wir vermehrten beide Zelltypen in DMEM (Gibco), das mit 2 mM L-Glutamin, 10 % fetalem Kälberserum und Antibiotika (Streptomycin, 100 mg/ml und Penicillin, 100 U/ml) ergänzt wurde.
Overlay-Medien
Als flüssiges Erhaltungsmedium (MM) für die Virusinfektion wurde Eagle’s MEM mit L-Glutamin, 0,1 % BSA (Sigma, A-0336), Antibiotika und 1 μg/ml TPCK-Trypsin (Sigma, T-1426) verwendet.
Stämme von 1,8 % Bacto-Agar (BD, 214010) und 2 % Methylcellulose (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s bei 2 %, Fluka) in destilliertem Wasser wurden wie zuvor beschrieben hergestellt.
Der Hersteller von Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) stellte freundlicherweise drei Typen von Avicel (RC-581, RC-591 und CL-661) für die Tests zur Verfügung. Wir stellten Avicel-Suspensionen her, indem wir 2,4 g Avicel-Pulver in 100 ml destilliertem Wasser auf einem Standard-Magnetrührer für 1 Stunde dispergierten. Agar-, MC- und Avicel-Bestände wurden durch 20-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisiert und bei Raumtemperatur gelagert.
Die Overlays wurden durch Mischen von Stammlösungen von MC, Avicel oder geschmolzenem Agar mit gleichen Volumina eines doppelt so starken Erhaltungsmediums hergestellt. Um die Konzentration von MC und Avicel in den Overlays zu variieren, verdünnten wir die Originalbestände mit sterilem Wasser. Der Agar-Overlay wurde bei 42-44°C hergestellt, die beiden anderen Overlays bei 20 oder 37°C.
Konzentrierte (2,4%) Avicel-Bestände trennten sich in der Regel nicht während der Lagerung, verdünnte Overlays auf Avicel-Basis waren jedoch weniger stabil. Falls erforderlich, mischten wir die Avicel-Bestände und mischten die Avicel-Overlays immer vor der Verwendung, indem wir sie entweder mit der Hand schüttelten oder vortexten. Eine langsame Trennung der Overlays nach ihrer Anwendung auf den Zellmonolayern hatte keinen Einfluss auf die Testergebnisse.
Plaque-Assay in 6-Well-Platten
Eine Stunde nach der Infektion der Zellmonolayer mit 30-50 plaquebildenden Einheiten des Virus in 1 ml Erhaltungsmedium ohne Trypsin entfernten wir das Virusinokulum, bedeckten die Zellen mit 3 ml der verschiedenen Overlay-Medien und bebrüteten die Kulturen bei 35°C in einer 5%igen CO2-Atmosphäre. Bei den MC- und Avicel-Overlays wurde darauf geachtet, die Platten während der Inkubation nicht zu stören, um die Bildung ungleichmäßiger Plaques zu vermeiden. Nach drei Tagen Inkubation wurden die Overlays entfernt und die Zellen fixiert. Agar-Overlay wurde mit einem Metallspatel entfernt; MC-, Avicel- und Flüssigkeits-Overlay wurden durch Absaugen entfernt. Die Zellen wurden mit 4%iger Paraformaldehydlösung in MEM für 30 Minuten bei 4°C fixiert und mit PBS gewaschen. Alle nachfolgenden Behandlungen der Zellen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Wir haben die Zellen permeabilisiert und gleichzeitig restliche Aldehydgruppen blockiert, indem wir die Zellen 10-20 Minuten mit 1 ml/Vertiefung einer Lösung mit 0,5 % Triton-X-100 und 20 mM Glycin in PBS inkubiert haben. Wir färbten virusinfizierte Zellen immun, indem wir sie 1 Stunde lang mit monoklonalen Antikörpern inkubierten, die für das Nukleoprotein des Influenza-A-Virus spezifisch sind (freundlicherweise von Dr. Alexander Klimov von den Centers for Disease Control, USA, zur Verfügung gestellt), gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation mit Peroxidase-markierten Anti-Maus-Antikörpern (DAKO, Dänemark) und einer 30-minütigen Inkubation mit Präzipitat-bildenden Peroxidase-Substraten. Für die Herstellung der Arbeitsverdünnungen der Immunreagenzien wurde eine Lösung aus 10 % normalem Pferdeserum und 0,05 % Tween-80 in PBS verwendet. Wir wuschen die Zellen nach den primären und sekundären Antikörpern, indem wir sie dreimal für 3-5 Minuten mit 0,05 % Tween-80 in PBS inkubierten. Als Peroxidase-Substrate verwendeten wir entweder gebrauchsfertiges True Blue™ (KPL) oder eine Lösung von Aminoethylcarbazol (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml), die in 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 5,5 und mit 0,03 % H2O2 hergestellt wurde. Die gefärbten Platten wurden mit Leitungswasser gewaschen, um die Reaktion zu stoppen, und getrocknet. Im Falle der True Blue-Färbung, die in Wasserlösungen relativ instabil ist, wurden die Platten auf dem Kopf stehend getrocknet, um das Ausbleichen zu minimieren. Die gefärbten Platten wurden mit einem Flachbettscanner gescannt und die Daten mit Adobe Photoshop 7.0 erfasst.
Alternativ zur Immunfärbung haben wir in einigen Experimenten die Plaques als Bereiche zerstörter Zellen dargestellt. Zu diesem Zweck färbten wir die Zellen nach dem Entfernen der Overlays mit 1%iger Kristallviolettlösung in 20%igem Methanol in Wasser an.
Varianten der Virustitration in 96-Well-Platten
1. Standardvariante
Wir infizierten MDCK- oder MDCK-SIAT1-Zellmonolayer in 96-Well-Platten mit 50 μl/Vertiefung serieller Verdünnungen des Virus im Erhaltungsmedium ohne Trypsin. Nach einer einstündigen Inkubation bei 35 °C und 5 % CO2 entfernten wir das Virus, fügten 100 μl/Vertiefung entweder MC- oder Avicel-Overlay-Medium hinzu und inkubierten die Zellen weitere 24 Stunden, um die Plaquebildung zu ermöglichen. Fixierung und Immunfärbung erfolgten wie oben für 6-Well-Platten beschrieben, jedoch unter Verwendung von 50 μl Reagenzien pro Vertiefung.
2. Vereinfachte Variante
Der Test wurde genau wie bei der Standardvariante mit den folgenden Änderungen durchgeführt. Nach 1 h Inkubation mit dem Virus wurde das Inokulum nicht entfernt. Wir fügten 100 μl/Vertiefung Avicel-Overlay-Medium hinzu und mischten die Platte entweder durch Klopfen mit der Hand oder mit einem Plattenmischer. Die Medien enthielten erhöhte Mengen an Trypsin (1,5 μg/ml), um die Verdünnung des Overlays mit dem virushaltigen Material in den Vertiefungen auszugleichen.
Plaque-Inhibitionstest
Noel Roberts (Roche Products, UK) stellte freundlicherweise den Neuraminidase-Inhibitor Oseltamivir Carboxylat (OC) zur Verfügung. Wir gaben 50 μl/Vertiefung serieller 10-facher Verdünnungen von OC in Erhaltungsmedium ohne Trypsin (Konzentrationsbereich von 4 nM bis 400 μM OC) zu Monolayern von MDCK-SIAT1-Zellen in 96-Well-Platten. Dann fügten wir 50 μl/Vertiefung Virusverdünnungen hinzu (20-40 plaquebildende Einheiten pro Vertiefung). Wir mischten die Platte und bebrüteten sie 1 Stunde lang bei 35 °C, damit die virale Infektion beginnen konnte. Danach fügten wir 100 μl/Vertiefung 1,2 % Avicel-Overlay-Medium mit 2 μg/ml Trypsin hinzu, bebrüteten die Kulturen 24 Stunden lang und fixierten und färbten sie immun wie oben beschrieben.
Im Falle von 6-Well-Platten fügten wir 0,75 ml Aliquots des Medikaments und des Inhibitors und 1,5 ml Aliquot von Avicel pro Vertiefung hinzu und färbten die Plaques 3 Tage nach der Infektion immun.