Umwandlung von mRNA in doppelsträngige cDNA

Die enzymatische Umwandlung von mRNA in doppelsträngige Insertions-DNA kann durch eine Reihe verschiedener Verfahren erreicht werden. Alle beinhalten die Einwirkung von reverser Transkriptase und eine mit Oligonukleotiden angereicherte Synthese von cDNA. Danach weichen die gebräuchlichen Verfahren erheblich voneinander ab. Es gibt eine Reihe von Methoden zur Synthese des zweiten Strangs und mehrere Verfahren zur Herstellung geeigneter Enden für die Herstellung klonierbarer DNA. Die Hauptziele dieser Verfahren sind die Konstruktion einer möglichst langen Insert-DNA mit einer hohen Ausbeute bei der Umwandlung von mRNA in DNA, die an Vektor-DNA ligieren kann. Die folgenden Protokolle erfordern nur handelsübliche Reagenzien und sind in der Regel erfolgreich bei der Herstellung guter cDNA-Bibliotheken. Das Basisprotokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung von cDNA mit stumpfen Enden, die dann an Linker ligiert werden kann, um anschließend an eine eindeutige Restriktionsstelle wie EcoRI zu klonieren. Das alternative Protokoll ist eine Variante, die weniger enzymatische Manipulationen erfordert und den Aufbau gerichteter cDNA-Bibliotheken ermöglicht, was besonders dann wünschenswert ist, wenn das Ziel darin besteht, cDNA-Expressionsbibliotheken zu erzeugen. Das alternative Protokoll nutzt einen Linker-Primer, der (in der Reihenfolge von 3′ bis 5′) aus einem Oligo(dT)-Primer, einer Restriktionsstelle für die XhoI-Endonuklease und einer (GA)20-Wiederholung besteht, um die Restriktionsstelle während der Erzeugung der Blunt-End-cDNA zu schützen. Die internen XhoI-Stellen auf den einzelnen cDNA-Molekülen werden durch den Einbau von 5-Methyl-dCTP in die Nukleotidmischung des ersten Strangs geschützt. Die resultierenden cDNAs mit eindeutigen Enden können in EcoRI /XhoI-verdaute Vektoren kloniert werden, nachdem EcoRI-Adaptoren an das 5′-Ende ligiert und durch XhoI verdaut wurden, um die 3′-XhoI-Stellen freizusetzen, die durch das Linker-Primer in die cDNA eingebaut wurden. Diese Änderungen führen zu einem erheblich gestrafften Verfahren, das wesentlich schneller und einfacher ist als das Basisprotokoll.