Braz J Med Biol Res, October 2003, Volumen 36(10) 1447-1454
El gen de la 5alfa-reductasa tipo 1, pero no el tipo 2, se expresa en los pelos anágenos arrancados del área del vértice del cuero cabelludo de mujeres hirsutas e individuos normales
I.O. Oliveira1,2, C. Lhullier1, I.S. Brum1 y P.M. Spritzer1,3
1Departamento de Fisiología, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
3Unidade de Endocrinologia Ginecológica, Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil
Resumen
Resumen 
El objetivo del presente estudio fue determinar la expresión de los genes de las isoenzimas de la 5a- tipo 1 (SDR5A1) y tipo 2 (SDR5A2).reductasa en pelos del cuero cabelludo arrancados a 33 pacientes hirsutas (20 con síndrome de ovario poliquístico y 13 con hirsutismo idiopático) y compararla con la de 10 hombres y 15 mujeres normales. La expresión de SDR5A1 y SDR5A2 se estimó mediante RT-PCR utilizando el gen de la proteína de expresión ubicua ß2-microglobulina como control interno. Los resultados se expresan como unidades arbitrarias en relación con la absorbancia de la ß2-microglobulina (media ± SEM). La expresión de SDR5A2 no se detectó en ninguna de las muestras de pelo analizadas en este estudio. No se encontraron diferencias en los niveles de ARNm de SDR5A1 entre hombres y mujeres normales (0,78 ± 0,05 frente a 0,74 ± 0,06, respectivamente). La expresión del gen SDR5A1 en las células del cabello arrancado del cuero cabelludo de las mujeres normales (0,85 ± 0,04) y de las mujeres con síndrome de ovario poliquístico (0,78 ± 0,05) e hirsutismo idiopático (0,80 ± 0,06) también fue similar. Estos resultados indican que la expresión del gen SDR5A1 en los queratinocitos foliculares de la zona del vértice del cuero cabelludo no parece estar relacionada con las diferencias en el crecimiento del pelo observadas entre hombres y mujeres normales y pacientes hirsutos. Se necesitan más estudios para investigar la expresión de los genes de la 5a-reductasa en otros compartimentos foliculares del cuero cabelludo, como las papilas dérmicas, y también en los folículos pilosos de otras zonas del cuerpo, con el fin de dilucidar el mecanismo de acción de los andrógenos en el proceso de crecimiento del cabello y las enfermedades relacionadas.
Palabras clave: Folículo piloso, Hirsutismo, 5a-Reductasa, Síndrome de ovario poliquístico
Introducción
Los andrógenos son los principales reguladores del crecimiento del cabello humano y están asociados a uno de los principales trastornos clínicos del crecimiento del cabello, el hirsutismo. Esta condición corresponde al crecimiento excesivo de vello corporal en mujeres con un patrón masculino de distribución del vello corporal. La presencia de hirsutismo puede señalar condiciones asociadas con el aumento de la secreción de andrógenos por parte de los ovarios y/o las glándulas suprarrenales, como el síndrome de ovario poliquístico (SOP), los tumores secretores de andrógenos y la hiperplasia suprarrenal no clásica, o puede ser el resultado de una hipersensibilidad periférica a los andrógenos circulantes (hirsutismo idiopático, IH) (1-3). Aunque en general esta afección no supone una amenaza para la vida, es muy angustiosa para los pacientes y tiene un importante impacto psicosocial negativo. La investigación de los efectos de los andrógenos sobre el crecimiento del cabello en presencia de hirsutismo debería mejorar nuestro conocimiento de la biología del folículo piloso humano.
El efecto de todos los andrógenos activos sobre las células diana está mediado por su unión al mismo receptor nuclear de andrógenos. Estudios anteriores sobre los síndromes de resistencia a los andrógenos han revelado la importancia del receptor androgénico para el crecimiento del cabello dependiente de los andrógenos (4-6). Más recientemente, se ha observado un aumento de la capacidad de unión de los andrógenos en las células pilosas del cuero cabelludo de los hombres calvos (7). Sin embargo, hasta ahora no se ha encontrado ninguna diferencia consistente en el número o la función del receptor de andrógenos en los pacientes hirsutos en comparación con los sujetos normales (8,9).
Los folículos pilosos tienen un control autónomo sobre el metabolismo de los andrógenos, ajustando la producción y la degradación de las hormonas esteroides según las necesidades locales (10). En condiciones normales, la 5a-reductasa tiene un papel clave en la acción de los andrógenos en los folículos pilosos, convirtiendo la testosterona en el andrógeno más potente, la dihidrotestosterona (11,12). Los estudios de clonación molecular han caracterizado dos genes que codifican las isoenzimas de la 5a-reductasa de tipo 1 y de tipo 2 (13,14). La isoenzima de la 5a-reductasa que predomina en la piel es la de tipo 1 (SDR5A1) (15), que tiene un 60% de homología con la 5a-reductasa de tipo 2 (SDR5A2) que es característica de la glándula prostática (14). Se ha demostrado un aumento de la actividad de la 5a-reductasa en los fibroblastos de la piel genital y púbica de pacientes hirsutas en comparación con la piel de mujeres normales (8,16). Estos estudios han informado de un aumento de la actividad de la 5a-reductasa incluso en la IH, que se caracteriza por la ausencia de niveles elevados de andrógenos en plasma (17). Además, la piel púbica de los pacientes hirsutos expresa la misma isoforma SDR5A1 que la piel púbica de los sujetos normales, mientras que la SDR5A2 se expresa principalmente en la piel genital tanto de los sujetos normales como de los pacientes hirsutos (18). Sin embargo, el papel fisiológico de las isoenzimas de la 5a-reductasa no se conoce del todo y su distribución en los distintos compartimentos de la piel sigue sin estar clara. Algunos estudios inmunohistoquímicos y de actividad enzimática han sugerido una expresión predominante de la enzima SDR5A1 en las glándulas sebáceas, pero también en las glándulas sudoríparas, las células epidérmicas, la vaina radicular y las células de la papila dérmica de los folículos pilosos (19-21), mientras que la SDR5A2 sólo se expresa en estos compartimentos a niveles muy bajos. En cambio, otros estudios han demostrado una distribución diferente de estas isoenzimas dentro de la unidad pilosebácea (22-24). Parece haber una mayor distribución de SDR5A1 en los compartimentos del folículo piloso en comparación con SDR5A2. Además, dado que los queratinocitos de la vaina de la raíz muestran una elevada expresión del gen SDR5A1, probablemente desempeñan un papel importante en el metabolismo de los andrógenos en los folículos pilosos.
El objetivo del presente estudio fue evaluar la expresión de los genes SDR5A1 y SDR5A2 en las células de la vaina de la raíz del cabello de la zona del vértice del cuero cabelludo de pacientes hirsutos y compararla con la de sujetos normales de ambos sexos.
Pacientes y métodos
Sujetos
La población de estudio incluyó mujeres que consultaron por hirsutismo atendidas consecutivamente durante un período de 6 meses en la Unidad de Endocrinología Ginecológica del Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil. Se seleccionaron para el estudio 33 pacientes con edades comprendidas entre 12 y 42 años. Veinte pacientes fueron diagnosticadas con SOP y 13 con HI. El diagnóstico de SOP se basó en las características físicas de hiperandrogenismo, ciclos menstruales alterados, niveles elevados de hormona luteinizante (LH) en suero o relación LH/hormona foliculoestimulante, niveles elevados de testosterona total y/o índice de andrógenos libres (IAL), evidencia ecográfica de ovarios poliquísticos bilaterales agrandados (25,26) y ausencia de neoplasia ovárica o suprarrenal o síndrome de Cushing. La IH se diagnosticó según lo descrito anteriormente (27) en pacientes hirsutas con ciclos ovulatorios regulares (niveles de progesterona en fase lútea superiores a 3,8 ng/ml), niveles de andrógenos normales y sin ninguna enfermedad subyacente conocida.
Las pacientes con hiperplasia suprarrenal congénita de inicio tardío (no clásica) no se consideraron para el estudio sobre la base de un nivel plasmático elevado de 17-hidroxiprogesterona (>5 ng/ml) y/o su marcado aumento tras la estimulación con ACTH (>12 ng/ml) (28,29). También se excluyeron los pacientes con hiperprolactinemia (niveles de prolactina sérica superiores a 20 µg/l en dos ocasiones diferentes).
También se seleccionaron para el estudio quince mujeres normales con ciclos menstruales regulares de 16 a 37 años y diez hombres de 16 a 29 años, que fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Se obtuvo el consentimiento informado de cada sujeto. Ninguno de los sujetos había recibido ningún fármaco que interfiriera con los niveles séricos de andrógenos, estrógenos o gonadotropinas durante al menos 3 meses antes del estudio.
Los niveles de ARNm de SDR5A1 y SDR5A2 se estimaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) en células capilares arrancadas de la parte del vértice del cuero cabelludo de hombres normales, mujeres normales y pacientes hirsutos.
Protocolo de estudio
Las mediciones antropométricas incluyeron el peso corporal, la altura y el índice de masa corporal (IMC = peso actual medido en kg dividido por la altura en m2). La puntuación de hirsutismo se calificó mediante el método de Ferriman-Gallwey (30), excluyendo las zonas de la parte inferior de la pierna y del antebrazo.
La evaluación hormonal se realizó entre el día 2 y el 10 del ciclo menstrual o en cualquier día en que las pacientes estuvieran amenorreicas. Tras una noche de ayuno, se extrajeron muestras de sangre de una vena antecubital para determinar la LH, la globulina fijadora de hormonas sexuales (SHBG) y la testosterona total. Todas las muestras se obtuvieron entre las 8 y las 10 de la mañana. El IAF se estimó dividiendo la testosterona total (nmol/l) por la SHBG (nmol/l) x 100.
Ensayos
La testosterona total se midió por radioinmunoanálisis de doble anticuerpo (ICN, Costa Mesa, CA, USA), con un límite de detección del ensayo de 0.04 ng/ml y un coeficiente de varianza (CV) intra e interensayo del 10 y el 15%, respectivamente; la SHBG se midió mediante un ensayo inmunoquimioluminométrico (ICMA; DPC, Los Ángeles, CA, EE.UU.), con un límite de detección de 0,2 nmol/l, y un CV intra e interensayo del 5,0 y el 8,0%, respectivamente. La LH se midió mediante ICMA, con un límite de detección de 0,7 mIU/ml y un CV intra e interensayo de 5,2 y 8,0%, respectivamente.
Protocolo de RT-PCR
Se recogieron pelos anágenos arrancados del vértice del cuero cabelludo de todos los sujetos y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se transportaron al laboratorio para los ensayos. La extracción del ARN total y la síntesis del ADNc se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente (31). Las raíces capilares arrancadas se homogeneizaron en isotiocianato de fenol-guanidina (Trizol, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA). El ARN total se extrajo con cloroformo y se precipitó con isopropanol mediante centrifugación a 12.000 g a 4ºC. El pellet de ARN se lavó dos veces con etanol al 75%, se resuspendió en agua tratada con dietilpicarbonato y se cuantificó por absorbancia a 260 nm.
La primera cadena de ADNc se sintetizó a partir de 5 µg de ARN total para todas las reacciones utilizando el sistema de preamplificación SuperScript (Gibco-BRL). Tras desnaturalizar el ARN molde y los cebadores a 70ºC durante 10 minutos, se añadió la transcriptasa inversa en presencia de 20 mM de Tris-HCl, pH 8,4, más 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 0,5 mM de mezcla de dNTP y 10 mM de ditiotreitol, y se incubó a 42ºC durante 55 minutos. La mezcla se calentó a 70ºC para detener la reacción y luego se incubó con RNasa de E. coli durante 20 min a 37ºC para destruir el ARN no transcrito. El molde (ADNc) utilizado en los diferentes ensayos de PCR se obtuvo de la misma reacción de transcripción inversa. La PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 µl. Dos microlitros de la reacción de síntesis de la primera cadena (con un rendimiento esperado de ADNc de 10 ng) se desnaturalizaron a 94ºC durante 3 min (2 min sólo para la ß2-microglobulina) en presencia de 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, más 50 mM KCl y 1,5 mM MgCl2. Tras este arranque en caliente, se añadieron 1,25 U de Taq ADN polimerasa junto con el mismo tampón Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 0,4 µM de cebadores sentido y antisentido y 0,2 mM de mezcla de dNTP.
Se amplificaron un fragmento de 368 pb de la secuencia de ADNc de SDR5A1 (24) y un fragmento de 566 pb de la secuencia de SDR5A2 (14) utilizando cebadores diseñados para abarcar los bordes del intrón-exón con el fin de evitar la amplificación de cualquier ADN genómico contaminante. Se amplificó un fragmento de ADNc de 623 pb correspondiente a la proteína de expresión ubicua ß2-microglobulina (32) para normalizar las cantidades de ADNc en cada muestra. Las secuencias de ADNc de los cebadores de SDR5A1 y SDR5A2 y de la ß2-microglobulina se enumeran en la Tabla 1. La PCR se estandarizó probando un número de ciclos (20 a 45) y la amplificación se realizó en el rango lineal. Las condiciones finales de la PCR fueron las siguientes 35 ciclos (45 s a 94ºC, 45 s a 60ºC, 90 s a 72ºC, 10 min a 72ºC) para SDR5A1, 40 ciclos (1 min a 94ºC, 1 min a 65ºC, 2 min a 72ºC, 5 min a 72ºC) para SDR5A2, y 30 ciclos (1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC, 1 min a 72ºC, 5 min a 72ºC) para ß2-microglobulina. El ADNc de células disociadas de la glándula prostática humana se utilizó como control positivo para todas las reacciones de PCR. No se añadió ADNc a las reacciones negativas. Una muestra de la mezcla de PCR (15 µl) se fraccionó por tamaño en un gel de agarosa al 1,5-2,0% teñido con bromuro de etidio, corrido a 100 V y visualizado bajo luz UV. Las bandas esperadas se cuantificaron mediante un análisis densitométrico utilizando un sistema de procesamiento de imágenes (ImageMaster VDS, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia).
Análisis estadístico
Los datos se presentan como medias ± SEM, a menos que se indique lo contrario. Las medias de los grupos se compararon mediante la prueba t de Student o mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de Duncan, y las medianas se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P < 0,05. Todos los análisis se realizaron con el programa Statistical Packages for the Social Sciences (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
La tabla 2 resume los datos antropométricos y hormonales de las pacientes con SOP e IH. No se observaron diferencias significativas entre los dos grupos de pacientes hirsutas en cuanto a la edad o la puntuación clínica de hirsutismo. Sin embargo, las pacientes hirsutas con SOP presentaban un IMC más elevado y mostraban niveles de testosterona, IAF y LH significativamente más elevados que el grupo de IH. Las concentraciones de SHBG fueron más bajas en el grupo con SOP que en el grupo con HI.
La expresión del gen SDR5A2 no se detectó en ninguna de las muestras de pelo del cuero cabelludo analizadas mediante RT-PCR en el presente estudio (Figura 1).
La Figura 2 muestra los niveles de ARNm de SDR5A1 en las células de pelo arrancadas del cuero cabelludo de sujetos normales. La expresión de SDR5A1, presentada como unidades arbitrarias en relación con la absorbancia de ß2-microglobulina, fue similar en los hombres (0,78 ± 0,05) y en las mujeres normales (0,74 ± 0,06). Además, no se observaron diferencias significativas en la expresión de SDR5A1 de los queratinocitos foliculares entre las mujeres normales (0,85 ± 0,04) y los grupos hirsutos del SOP (0,78 ± 0,04) o del HI (0,80 ± 0,06) (Figura 3).
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Figura 1. Gel de agarosa representativo teñido con bromuro de etidio que muestra la ausencia de expresión del ARNm de SDR5A2 por RT-PCR en las células pilosas arrancadas del cuero cabelludo de hombres (1 a 9), mujeres normales (10 a 17) y pacientes hirsutas: Grupo PCOS (18 a 31) y grupo IH (32 a 39). El fragmento de 566 pb corresponde a SDR5A2 (5a-R2) y el de 623 pb a ß2-microglobulina (ß2-m). La amplificación de SDR5A2 se visualizó sólo en las células prostáticas disociadas utilizadas como control positivo (+). |
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Figura 2. Gel representativo que muestra los niveles de ARNm de SDR5A1 determinados por RT-PCR en células capilares arrancadas del cuero cabelludo de hombres (1 a 7) y mujeres normales (8 a 14). El fragmento de 368 pb corresponde a SDR5A1 (5a-R1) y el fragmento de 623 pb corresponde a la ß2-microglobulina (ß2-m). Los productos de la RT-PCR se visualizaron en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. + = control positivo. |
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Figura 3. Gel representativo que muestra los niveles de ARNm de SDR5A1 determinados por RT-PCR en células capilares arrancadas del cuero cabelludo de mujeres normales (1 a 14) y de ambos grupos de pacientes hirsutas (PCOS: 15 a 26; IH: 27 a 35). El fragmento de 368 pb corresponde a SDR5A1 (5a-R1), y el de 623 pb a ß2-microglobulina (ß2-m). Los productos de la RT-PCR se visualizaron en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. |
Discusión
Aunque la actividad de la 5a-reductasa de la piel se asocia con el hirsutismo, el papel específico y la identificación de la isoenzima implicada en esta condición clínica de crecimiento del pelo aún deben ser mejor definidos. En el presente estudio, investigamos la expresión del ARNm de ambos tipos de 5a-reductasa en las células capilares anágenas del cuero cabelludo desplumadas de pacientes hirsutos.
El gen SDR5A1 se expresó en las células capilares desplumadas obtenidas del vértice del cuero cabelludo de sujetos normales. Otros estudios han demostrado resultados similares, incluso cuando se investigó el ARNm de SDR5A1 en queratinocitos foliculares cultivados (24,33). Los pelos anágenos arrancados están constituidos principalmente por células de queratinocitos que forman vainas radiculares externas e internas. La vaina de tejido conectivo, el bulbo inferior, las células de la papila dérmica y la glándula sebácea están ausentes en los pelos arrancados. Por lo tanto, nuestros datos confirman la expresión génica de SDR5A1 en los queratinocitos foliculares, y están de acuerdo con otros, que mostraron la inmunorreactividad de la 5a-reductasa en las células de la vaina de la raíz de los folículos pilosos (20,23).
En el presente estudio, los niveles de ARNm de SDR5A1 de los pelos arrancados del cuero cabelludo no difirieron entre hombres y mujeres normales. Estudios anteriores también han descrito una actividad similar de la 5a-reductasa en los folículos pilosos de hombres y mujeres (12,34). En cambio, se detectó una mayor actividad de la 5a-reductasa en muestras de piel púbica en hombres normales que en mujeres normales (1). En conjunto, estos resultados sugieren que en los individuos normales la regulación de la 5a-reductasa parece diferir entre los queratinocitos foliculares del cuero cabelludo y los fibroblastos de la piel púbica.
Las células del folículo piloso del cuero cabelludo no parecen ser el objetivo principal del hirsutismo. Sin embargo, existen algunas dificultades éticas para obtener muestras de la cara de los pacientes hirsutos. Además, hay pocos informes en la literatura sobre los mecanismos moleculares de las células del folículo piloso del cuero cabelludo en presencia del hirsutismo (9). La región del cuero cabelludo es un lugar bien conocido como sensible a los andrógenos en ambos sexos y es relativamente fácil obtener una muestra de pelos del cuero cabelludo. Por lo tanto, es interesante investigar algunos aspectos del metabolismo de los andrógenos en las células pilosas arrancadas del cuero cabelludo, especialmente cuando es posible comparar sujetos con una exposición endógena a niveles de andrógenos circulantes más elevados (SOP) o normales (IH).
No observamos ninguna diferencia en los niveles de ARNm de SDR5A1 en los queratinocitos foliculares ni entre pacientes hirsutos y mujeres normales ni entre hombres y mujeres normales. Además, las pacientes con niveles séricos de andrógenos elevados (grupo SOP) presentaron la misma expresión génica de SDR5A1 que las que tenían niveles de IH y andrógenos normales. Aunque el SDR5A1 es la isoenzima que predomina en la piel (14), los presentes resultados indican que los andrógenos circulantes probablemente no contribuyen a la expresión génica del SDR5A1 en los queratinocitos foliculares del cuero cabelludo, lo que sugiere que el SDR5A1 no es la isoenzima clave en el metabolismo local de los andrógenos de la piel del cuero cabelludo. Por otro lado, se ha demostrado la eficacia del inhibidor de la 5a-reductasa finasterida en el tratamiento de la pérdida de cabello de patrón masculino (35), así como en el IH (36,37). La finasterida es un inhibidor activo por vía oral que bloquea preferentemente la 5a-reductasa de tipo 2, pero que también puede inhibir la isoenzima de tipo 1, provocando una marcada disminución de los niveles de dihidrotestosterona y glucurónido de 3a-androstenediol. No tiene afinidad por el receptor de andrógenos ni efectos androgénicos, estrogénicos, progestacionales u otros efectos esteroideos (38). De acuerdo con nuestros resultados, estos estudios indicaron que la 5a-reductasa tipo 2 probablemente tiene un papel más crítico en el proceso de crecimiento del cabello y en las condiciones clínicas relacionadas.
Los presentes resultados muestran que el gen SDR5A2 no se expresó en los queratinocitos foliculares de ningún sujeto, ni de hombres ni de mujeres normales ni de pacientes hirsutos. Estudios anteriores han descrito la localización preferente del ARNm y de la actividad enzimática del SDR5A2 (39,40) en las células de la papila dérmica, aunque también se ha encontrado inmunorreactividad del SDR5A2 en los queratinocitos del folículo piloso (20,22). Las aparentes discrepancias en la expresión proteica entre estos estudios pueden explicarse, al menos en parte, por los diferentes métodos de análisis inmunohistoquímico de los datos cualitativos. En cuanto a la ausencia de expresión del gen SDR5A2, descrita en el presente estudio, es posible que métodos más sensibles de análisis de la expresión génica, por ejemplo, la PCR en tiempo real, aclaren esta cuestión en el futuro.
No hemos investigado la expresión génica de las isoenzimas de la 5a-reductasa en otros compartimentos foliculares como las papilas dérmicas porque estas células no están presentes en los pelos aislados arrancados. Las células de la papila dérmica sólo se obtienen por biopsia de escisión, que es un método invasivo y estresante. Sin embargo, será muy interesante investigar las isoenzimas de la 5a-reductasa en las células de la papila dérmica de los pacientes hirsutos, ya que se ha sugerido que estas células pueden ser la diana directa de los andrógenos en los folículos pilosos, regulando la actividad de la matriz capilar, los melanocitos y los queratinocitos con señales paracrinas (10).
La expresión del gen SDR5A1 en los queratinocitos foliculares de la zona del vértice del cuero cabelludo no parece estar relacionada con las diferencias en el crecimiento del cabello observadas entre hombres y mujeres normales y pacientes hirsutos. Más investigaciones sobre la regulación de la expresión del gen de la 5a-reductasa en las células del folículo piloso en diferentes lugares del cuerpo pueden ayudar a dilucidar el intrigante mecanismo de la acción de los andrógenos en el proceso de crecimiento del cabello y las enfermedades asociadas.
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