- La hipoxia provoca un aumento en la expresión de los genes recA y recX de M. smegmatis recA y recX
- Construcción de cepas mutantes de ΔrecX y ΔrecA ΔrecX
- Análisis genotípico y fenotípico de M. smegmatis ΔrecX y ΔrecAΔrecX
- Las cepas mutantes ΔrecA y ΔrecA ΔrecX de M. smegmatis muestran un crecimiento deteriorado y un rendimiento celular reducido en relación con la cepa de tipo salvaje
- La supresión de recA, pero no de recX, hace que M. smegmatis sea más susceptible a los agentes que dañan el ADN
- Supervivencia tras el tratamiento con diferentes concentraciones de agentes que dañan el ADN
- La expresión de los genes recA y recX son inducidos por el daño del ADN
- Observaciones finales
- Las abreviaturas utilizadas son
La hipoxia provoca un aumento en la expresión de los genes recA y recX de M. smegmatis recA y recX
Durante el curso de la infección y la proliferación, M. tuberculosis se expone a condiciones de estrés fisiológico como la hipoxia y el estrés de pH ácido, que podrían comprometer su supervivencia38,39,40. Por ejemplo, el estrés hipóxico agudo detiene la replicación del ADN y desencadena un fuerte daño en el ADN41,42,43. Un aumento en la expresión de los genes de la vía SOS, incluyendo umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB, y uvrD, comienzan al dañar el ADN44,45,46. Con este fin, el perfil de expresión génica inducido por la hipoxia en M. smegmatis y M. tuberculosis durante la infección latente ha proporcionado información valiosa sobre la naturaleza de los bacilos tuberculosos latentes y su tratamiento47.
Estudios anteriores en M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 y Streptomyces lividans50 han demostrado que recA se co-transcribe con recX. Además, se descubrió que una sobreexpresión de RecA (un regulador positivo de la respuesta SOS) era tóxica en ausencia de RecX en ciertas especies bacterianas, como Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 y Xanthomonas oryzae53. Estos hallazgos son consistentes con la noción de que RecX actúa como una anti-recombinasa para sofocar eventos de recombinación inapropiados promovidos por RecA14. Por el contrario, una sobreexpresión de RecA en la cepa E. coli ΔrecX no es deletérea y la deleción de recX no afecta a la expresión de recA54. La transcripción de recX en E. coli está regulada a la baja en comparación con recA en condiciones normales de crecimiento debido a la existencia de un sitio de terminación de la transcripción entre las secuencias codificantes de recA y recX. Sin embargo, un transcrito de ARNm de recA-recX resultante de la lectura transcripcional se acumula en el rango del 5-10% del contenido total de ARNm de recA54. El transcrito de recX era apenas detectable durante el crecimiento vegetativo de E. coli, pero la expresión robusta de recX se produce tras el tratamiento con agentes que dañan el ADN15,55.
Los genomas de M. smegmatis y M. tuberculosis contienen una sola copia de recA y recX en un solo operón. Para investigar la expresión y la regulación de estos genes bajo crecimiento aeróbico e hipóxico en M. smegmatis, un modelo sustituto comúnmente utilizado para M. tuberculosis, se midió la abundancia relativa de ARNm en varias fases de crecimiento mediante un ensayo de RT-qPCR y se normalizó con la del gen 16S rRNA expresado constitutivamente. Los valores del umbral de ciclo (Ct) para los ARNm recA y recX de M. smegmatis se normalizaron con respecto al valor Ct del gen 16S rRNA. A diferencia de E. coli15,55, se observó una cantidad significativa de transcripciones de ARNm de recA en la fase inicial del ciclo bajo condiciones de cultivo tanto aeróbicas como hipóxicas (Fig. 1A). Curiosamente, las condiciones de hipoxia aumentaron la acumulación de ARNm de recA en 1,5 veces a la mitad de la fase log, y disminuyeron a partir de entonces cuando las células entraron en la fase estacionaria. Se observó un patrón similar con la abundancia de ARNm de recX tanto en condiciones aeróbicas como hipóxicas, aunque a niveles reducidos (Fig. 1B). Estas observaciones apoyan la idea de que los dos genes están co-transcritos y regulados de forma coordinada bajo condiciones de crecimiento aeróbico e hipóxico. Curiosamente, no se observó ninguna diferencia en las cantidades de ARNm en condiciones de crecimiento aeróbico e hipóxico en la fase inicial del ciclo. Los perfiles transcripcionales de los genes marcadores específicos de la fase de crecimiento de M. smegmatis (sigH2 y sigH7)56 se utilizaron para determinar los tiempos de las fases log temprana, log media y estacionaria (Fig. 1C). En las cepas clínicas multirresistentes de M. tuberculosis, los niveles de ARNm de recA y recX resultaron ser más elevados que en las cepas susceptibles a los fármacos y los niveles de ARNm de recX aumentaron de forma concomitante con un aumento del ARNm de recA57.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los niveles de ARNm no pueden utilizarse como sustitutos de los niveles de proteínas correspondientes. Por lo tanto, la abundancia de las proteínas RecA y RecX en M. smegmatis se midió en condiciones aeróbicas e hipóxicas mediante un ensayo de Western blot utilizando anticuerpos anti-RecA y anti-RecX. Se sondeó GroEL como control de carga de proteínas. El análisis densitométrico de los inmunoblots reveló que las células acumulaban mayores niveles de RecA en condiciones de crecimiento hipóxico en comparación con las condiciones aeróbicas (Fig. 2A,B). Un análisis comparativo mostró que las células acumulaban de forma consistente niveles 2 veces mayores de RecA en las fases media y temprana bajo condiciones de crecimiento aeróbico, que disminuían en la fase estacionaria hasta los niveles observados en la fase temprana (Fig. 2A,B). Se observó un patrón similar para RecX, aunque los niveles fueron menos pronunciados que los de RecA (Fig. 2A,C). Aunque los patrones de expresión del ARNm y de la proteína eran comparables, se observaron importantes diferencias. En primer lugar, la proteína RecX era apenas detectable en la fase inicial de la logia durante las condiciones de hipoxia. En segundo lugar, la abundancia del ARNm y de la proteína RecA fue mayor en comparación con RecX.
Aunque estos resultados sugieren que los genes recA y recX de M. smegmatis se inducen en condiciones de hipoxia, no hay correlación entre la cantidad de ARNm de recX y la proteína correspondiente en la fase inicial-log. Se ha demostrado que tanto M. tuberculosis como M. smegmatis estabilizan sus transcritos de ARNm en condiciones de inhibición del crecimiento58,59,60. Entre los posibles mecanismos, se ha demostrado que la reprogramación del ARNt y la traducción selectiva con sesgo de codón desempeñan un papel en las micobacterias en respuesta a la hipoxia61. Una posible explicación de la falta de correlación entre el ARNm de recX frente al nivel de proteína en la fase logarítmica temprana podría deberse a la represión traslacional del ARNm de recX.
Construcción de cepas mutantes de ΔrecX y ΔrecA ΔrecX
La diferencia en los niveles de proteína RecA y RecX en M. smegmatis indican una posible regulación de la expresión génica a nivel de transcripción. En muchas bacterias estudiadas hasta ahora, el gen recX está localizado en la misma cadena de codificación aguas abajo de recA y los dos genes se co-transcriben48,50,53,54,62,63. Sin embargo, en el locus lexA-recA-recX de Xanthomonas pathovars, cada gen se expresa desde su propio promotor64. Además, en D. radiodurans65,66, B. subtilis67 y N. gonorrhoeae26, los genes recA y recX están separados por varios cientos de kb de longitud y se transcriben a partir de sus propios promotores.
En varias especies de micobacterias, así como en algunas otras bacterias, la región 5′ de la secuencia codificante de recX se solapa con la región 3′ del gen recA. El solapamiento es de 32 pb en M. smegmatis48, mientras que en M. tuberculosis68 y M. leprae69 el solapamiento es de 35 pb. El efecto de la deleción de recX en las características fenotípicas se ha estudiado en varios organismos7,10. Los mutantes knockout de recX muestran una serie de fenotipos asociados a las funciones de RecA: la inactivación de recX de B. subtilis hizo que las células fueran sensibles al MMS y al H2O225, los mutantes de recX de S. lividans mostraron una menor resistencia al daño por rayos UV42 y el mutante de recX de N. gonorrhoeae mostró una pequeña disminución de su capacidad para sobrevivir al daño del ADN causado por roturas de doble cadena26. Sin embargo, no se ha investigado en ningún organismo el impacto de la deleción de los genes recA y recX en las características de crecimiento y reparación de daños en el ADN. Además, no se conoce del todo el papel in vivo de recX en las micobacterias.
Estudios anteriores han demostrado que la cepa M. smegmatis ΔrecA muestra sensibilidad al daño del ADN inducido por la radiación UV y no promueve la HR52. Combinamos la mutación recA con la deleción de recX para investigar los efectos de las dobles mutaciones. Para ello, se generaron cepas mutantes de M. smegmatis mc2155 recX simple y recArecX doble. Como control, se volvió a evaluar el efecto de la deleción de recA en M. smegmatis para su comparación directa. Utilizando el método de recombinación, que se basa en un protocolo desarrollado para M. tuberculosis y M. bovis BCG28, se generaron los mutantes M. smegmatis mc2155 ΔrecA y ΔrecAΔrecX utilizando construcciones lineales ΔrecA::hyg y ΔrecAΔrecX::hyg de 3,279 kb y 3,302 kb, respectivamente. Se generaron aproximadamente 100 ng de fragmentos lineales de ADN AES mediante la digestión por restricción de los respectivos plásmidos con EcoRV (Fig. 3A). Estos se transformaron en células competentes de M. smegmatis mc2155:pJV53 de recombinación70. Después de 4-5 días de incubación, se encontraron 8-10 colonias resistentes a Hyg para los mutantes ΔrecX y ΔrecAΔrecX. Las cepas mutantes putativas se examinaron mediante PCR para determinar si los genes recX y recArecX se habían eliminado del cromosoma (datos no mostrados). Los mutantes correctos se cultivaron en medio de agar Middlebrook 7H10 durante 5-8 generaciones para permitir la pérdida de pJV53.
Análisis genotípico y fenotípico de M. smegmatis ΔrecX y ΔrecAΔrecX
Tras el cribado por PCR, se obtuvieron 2 de cada uno de los mutantes knockout ΔrecX y ΔrecAΔrecX de M. smegmatis mc2155. Los mutantes ΔrecX y ΔrecAΔrecX se caracterizaron mediante mapeo con enzimas de restricción e hibridación Southern blot (Fig. 3). Tras la hibridación con sondas radiomarcadas adecuadas, se observó un fragmento de 4,1 kb en el caso de las células de M. smegmatis mc2155 de tipo salvaje. Los fragmentos predichos de 3,14 kb y 2,09 kb se observaron en los mutantes ΔrecX y ΔrecAΔrecX respectivamente (Fig. 3B,C). Ambas bandas son menores de 4,1 kb, lo que indica que los genes recX y recArecX han sido eliminados por sustitución alélica. La frecuencia de intercambio alélico con respecto a recX y recArecX estaba en el rango del 70% y el 80% respectivamente.
Una advertencia de este análisis es que los efectos observados de las mutaciones ΔrecX y ΔrecAΔrecX podrían ser el resultado de los efectos polares de la inserción del gen de resistencia a la higromicina. En general, las alteraciones genéticas en torno al locus recA-recX podrían dar lugar a efectos polares en la expresión de los genes situados aguas abajo del locus recA-recX. Se llevaron a cabo dos experimentos independientes para investigar los posibles efectos polares. En primer lugar, los mutantes ΔrecX y ΔrecAΔrecX se complementaron con las copias funcionales de los genes recA y recX. Se evaluó la capacidad de los transformantes para crecer en un medio de cultivo estándar y proteger las células mutantes contra la irradiación UV. Se colocaron diluciones seriadas de diez veces en placas de agar 7H10 y se analizaron. Como se muestra en la Fig. 4A,B, la recA de tipo salvaje complementó parcialmente las cepas mutantes ΔrecA y ΔrecAΔrecX, como se deduce de su capacidad para apoyar el crecimiento y proporcionar protección contra la irradiación UV. Sin embargo, la recX de tipo salvaje no pudo rescatar el fenotipo de las cepas mutantes ΔrecAΔrecX observado tras la inducción de daños en el ADN con irradiación UV. Dado que la supresión de recX no tuvo ningún efecto discernible sobre su crecimiento en condiciones normales y de daño al ADN, ΔrecX y su correspondiente cepa complementada mostraron un crecimiento similar al del tipo salvaje.
En segundo lugar, evaluamos la expresión de dos genes de M. smegmatis mc2155, gluD (MSMEG_2725) y glnH (MSMEG_2726), situados aguas abajo del locus recA-recX en las cepas mutantes ΔrecA ΔrecX y ΔrecX en comparación con la cepa de tipo salvaje. El gen hyd2 de M. smegmatis (MSMEG_2720) situado aguas arriba del locus recA-recX se utilizó como control positivo. El ARN total se preparó a partir de las cepas de tipo salvaje, ΔrecA ΔrecX y mutante ΔrecX. La abundancia relativa de los transcritos de los genes se determinó mediante RT-qPCR cuantitativa y se normalizó con respecto a la del gen cromosómico 16S rRNA de expresión constitutiva. Los niveles de expresión se midieron a partir de células cultivadas en la fase de crecimiento exponencial tardía. En todos los casos, los perfiles de expresión génica de los ORFs aguas arriba y aguas abajo fueron similares para las cepas de tipo salvaje y mutante (Fig. 4C). En conjunto, estos resultados excluyen la posibilidad de que la inserción del gen de resistencia a la higromicina provoque efectos polares.
Las cepas mutantes ΔrecA y ΔrecA ΔrecX de M. smegmatis muestran un crecimiento deteriorado y un rendimiento celular reducido en relación con la cepa de tipo salvaje
Para caracterizar la cepa M. smegmatis ΔrecX y las cepas mutantes ΔrecA ΔrecX, se midieron los perfiles de crecimiento de las cepas de tipo salvaje y de las cepas knockout en caldo Middlebrook 7H9 a 37 °C (Fig. 5). La deleción de recX no tuvo ningún efecto discernible (en comparación con la cepa de tipo salvaje) en el crecimiento de M. smegmatis. En condiciones similares, la deleción de recA aumentó notablemente la duración de la fase de retardo y redujo concomitantemente la fase de crecimiento exponencial, lo que sugiere que recA desempeña un papel en el crecimiento y la viabilidad de M. smegmatis. Además, estos resultados son consistentes con la función conocida de RecA en el rescate de horquillas de replicación estancadas o colapsadas71,72,73. Dado que los genes recA y recX forman un único operón, se investigó el impacto de su deleción en el crecimiento de M. smegmatis. La cepa ΔrecA ΔrecX knockout presentaba un fenotipo de crecimiento intermedio entre el mutante ΔrecA y la cepa de tipo salvaje; sin embargo, el crecimiento en las fases logarítmica tardía y estacionaria era similar al de las cepas ΔrecA y de tipo salvaje.
La supresión de recA, pero no de recX, hace que M. smegmatis sea más susceptible a los agentes que dañan el ADN
Al igual que otras eubacterias, la proteína RecA de las micobacterias desempeña un papel crucial en la regulación de la respuesta SOS tras el daño del ADN74,75,76,77. Para comprobar si la ausencia de recArecX y recX afecta a la capacidad de M. smegmatis para reparar eficazmente el ADN dañado, se expusieron los mutantes a una serie de agentes con mecanismos variados de daño al ADN. En estos experimentos, se indujo el estrés exponiendo las cepas mutantes ΔrecA, ΔrecX y ΔrecA ΔrecX a irradiación UV, MMS, H2O2 o ciprofloxacina durante la fase exponencial (OD600 de 0,6) del crecimiento bacteriano. Tras 3 horas de incubación, se lavaron las células y se evaluó su viabilidad manchando diluciones seriadas diez veces de los cultivos en placas de agar Middlebrook 7H10 que contenían higromicina (100 µg/ml). La concentración/dosis más adecuada de los agentes que dañan el ADN se determinó tras evaluar las diferencias de viabilidad celular entre las cepas mediante ensayos en placa. En ausencia de agentes dañinos para el ADN, todas las cepas mostraron niveles similares de viabilidad celular (Fig. 6). En cambio, en presencia de agentes que dañan el ADN, la cepa ΔrecA mostró un pronunciado defecto de crecimiento acompañado de una disminución de 100 veces en la eficiencia de chapado en relación con la cepa de tipo salvaje. Este fenotipo es coherente con la literatura disponible. Por el contrario, el efecto letal de la UV, el MMS o la ciprofloxacina, pero no del H2O2, fue parcialmente bloqueado por la deleción del gen recX en la cepa ΔrecA. Aunque la base de la falta de efecto del H2O2 no está clara, la concentración utilizada probablemente no era lo suficientemente alta como para afectar al crecimiento. Curiosamente, la cepa ΔrecX mostró un fenotipo ligeramente más resistente contra los cuatro agentes que dañan el ADN que la cepa ΔrecA ΔrecX, lo que indica una posible ganancia de función debido a la pérdida del gen recX. Teniendo en cuenta estos resultados, es evidente que recA desempeña un papel activo en la respuesta SOS y que la sensibilidad a los agentes que dañan el ADN está ligeramente suprimida en la cepa ΔrecX.
Supervivencia tras el tratamiento con diferentes concentraciones de agentes que dañan el ADN
Las micobacterias experimentan una serie de condiciones de estrés adversas, como el estrés oxidativo, nutricional e inducido por fármacos78,79,80,81,82. Para profundizar en las diferencias de viabilidad celular, se llevaron a cabo experimentos en los que se midió la viabilidad celular mediante unidades formadoras de colonias (UFC). En primer lugar, se comprobó la viabilidad de los mutantes M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX y ΔrecAΔrecX en comparación con la del tipo salvaje, desafiándolos con concentraciones crecientes de MMS. Las cepas se cultivaron en presencia de las concentraciones indicadas de MMS, hasta que los cultivos alcanzaron una DO600 de 0,6. La viabilidad de las células se evaluó colocando un número predeterminado de células en placas de agar 7H10. Las células se consideraron vivas si eran capaces de dividirse y formar colonias. Los mutantes, a diferencia de la cepa de tipo salvaje, mostraron una mayor sensibilidad al MMS en función de la concentración. El análisis cuantitativo indicó que el mutante ΔrecA mostraba una sensibilidad relativamente mayor al MMS, que aumentaba con el incremento de las concentraciones de MMS (Fig. 7A). En el caso de ΔrecX, las células eran ~2 veces menos sensibles al MMS en comparación con las células ΔrecA. Por otro lado, el mutante ΔrecA ΔrecX mostró más sensibilidad al MMS en contraste con el mutante ΔrecX. La sensibilidad del mutante ΔrecX al MMS indica que recX puede tener objetivos aún no identificados además de RecA. Esta suposición necesita más investigación.
A continuación, se analizaron las sensibilidades de las muestras de M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX y las cepas mutantes ΔrecA ΔrecX en relación con la cepa de tipo salvaje se determinaron exponiéndolas a concentraciones crecientes de H2O2. Los resultados muestran que la mutante ΔrecA fue menos sensible a este tratamiento (Fig. 7B). La deleción de recX sola, o la deleción del locus recA-recX, sólo tuvo un efecto menor en la viabilidad y proliferación de las células mutantes en respuesta al tratamiento con H2O2. En particular, las cepas mutantes ΔrecA y ΔrecAΔrecX mostraron un fenotipo de crecimiento sensible a la irradiación UV y a la ciprofloxacina que es significativamente mucho más grave que al MMS o al H2O2 (Fig. 7C,D). Además, la cepa ΔrecA mostró una mayor sensibilidad a la irradiación UV y a la ciprofloxacina que la cepa mutante doble ΔrecA ΔrecX.
La expresión de los genes recA y recX son inducidos por el daño del ADN
Los elementos reguladores aguas arriba del gen recA no se conservan en todas las especies de micobacterias. Por ejemplo, el gen recA de M. tuberculosis se transcribe desde dos promotores: ambos son inducibles por daño en el ADN, aunque a través de mecanismos diferentes. El promotor P1 de recA de M. tuberculosis (proximal al codón de inicio) puede ser inducido tras un daño en el ADN independientemente de las proteínas LexA y RecA. En cambio, el promotor P2 (situado lejos del codón de inicio de recA) está regulado por LexA, que es funcionalmente análogo al promotor de recA de E. coli83,84,85. Curiosamente, el mecanismo de inducción de daño en el ADN en M. tuberculosis no está totalmente conservado en M. smegmatis46,75. Estos hallazgos enfatizan la necesidad de entender la expresión y la regulación de los genes recA y recX de M. smegmatis y sus funciones en respuesta a los agentes que dañan el ADN.
Como se ha descrito anteriormente, la hipoxia causó un aumento en la expresión de los genes recA y recX de M. smegmatis (Fig. 1). Para corroborar aún más la noción de que la expresión de los genes recA y recX de M. smegmatis es inducible por el daño, se determinó la cinética de inducción con y sin daño en el ADN mediante RT-qPCR. Se prepararon muestras de ARN total a partir de células de M. smegmatis cosechadas a las 0, 3, 6, 9 y 12 horas después de la exposición a la luz UV, así como de cultivos no tratados, y se analizaron como se describe en la sección de Métodos. Los resultados no revelaron diferencias significativas entre los niveles de transcripción de recA y recX en las células no tratadas. Por el contrario, se observó un marcado aumento de los transcritos de ARNm de recA y recX 3 h después de la exposición a la radiación UV, y luego disminuyó ligeramente a partir de entonces. Una comparación de los datos de la RT-qPCR indica importantes diferencias entre los niveles de transcripción de recA y recX. La exposición a la radiación UV condujo a un aumento de ~8 veces en el ARNm de recA sobre el control, mientras que recX en ~3 veces (Fig. 8A,B). Así, aunque los ARNm de recA y recX existen en la misma unidad transcripcional, estos resultados apoyan la idea de que la producción y/o estabilidad del transcrito del ARNm de recX está sujeta a un mecanismo regulador postranscripcional adicional.
Estos resultados nos llevaron a realizar experimentos adicionales para determinar la cinética de acumulación de las proteínas RecA y RecX en células de M. smegmatis con o sin daño en el ADN. Se realizaron ensayos de Western blot en lisados de células enteras utilizando anticuerpos policlonales levantados contra RecA y RecX (Fig. 8C). La cuantificación de los Western blots mostró que las células contenían cantidades significativas de las proteínas RecA y RecX en las células no inducidas (Fig. 8D,E). En comparación, se observó un aumento de 2 veces en la abundancia tanto de RecA como de RecX (sobre el control) en las células 3 h después de la exposición a la radiación UV y disminuyó a partir de entonces. Es importante destacar que la inducción de las proteínas RecA y RecX mostró un patrón que recuerda al observado en las células en condiciones de hipoxia (Fig. 2), aunque es probable que los mecanismos por los que dañan el ADN sean diferentes.
Observaciones finales
Numerosos estudios han demostrado que recA y recX realizan una amplia gama de funciones relacionadas con la reparación y recombinación del ADN7,10. Hasta donde sabemos, no se han identificado los estímulos que activan la expresión de los genes recA y recX de M. smegmatis. En este estudio, se evaluaron los niveles de expresión de estos genes en células en crecimiento aeróbico y en respuesta a diversas condiciones de estrés. En M. smegmatis, al igual que en muchas especies bacterianas, recA y recX pertenecen al mismo operón, y el gen recX se localiza inmediatamente después del gen recA, y comparten regiones de codificación que se solapan86. Se descubrió que los agentes que dañan el ADN inducen la expresión de ambos genes en diferentes grados; sin embargo, las proporciones de expresión siguen un patrón similar. Curiosamente, los niveles tanto de RecA como de RecX se mantienen altos en condiciones de estrés en comparación con las condiciones de crecimiento aeróbico.
Varios estudios han demostrado papeles alternativos para RecX en la reparación recombinacional del ADN promovida por RecA. Mientras que la proteína RecX interactúa físicamente con RecA, y funciona como un potente inhibidor de todas las funciones conocidas de este último en muchas especies bacterianas14,46,48, potencia la recombinación homóloga en N. gonorrhoeae y B. subtilis25,26. Para conocer el papel de recX en la respuesta al estrés en micobacterias, se construyeron mutantes knockout de recX y recArecX de M. smegmatis. Curiosamente, la supresión de recX en M. smegmatis dio lugar a un fenotipo ligeramente más resistente contra los cuatro agentes que dañan el ADN, lo que indica una posible ganancia de función debido a la pérdida del gen recX. La base molecular de este efecto no está clara, por lo que merece la pena explorarla en futuros estudios. Aunque nuestro análisis se centró principalmente en la interacción genética entre recA y recX en la vía de reparación recombinacional del ADN, resulta interesante que recX parece desempeñar un papel importante en el crecimiento bacteriano. En resumen, estos hallazgos son coherentes con la idea de que recX de M. smegmatis desempeña un papel importante en los procesos de reparación/recombinación del ADN en condiciones adversas, tal vez regulando los efectos perjudiciales de un subconjunto de genes aún desconocidos.
Las abreviaturas utilizadas son
DTT, ditiotreitol; EDTA, ácido etilendiaminotetraacético; kb, kilobase; MMS, metilmetanosulfonato; ODN, oligonucleótido; PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida; PVDF: membrana de difluoruro de polivinilideno; RT-qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa; SDS: dodecil sulfato sódico; ssDNA: ADN monocatenario; SSC: 0.15 M NaCl-0,015 M citrato de sodio (pH 7,0).