- Kumman valita mikrobiomitutkimuksiin
- Mitä on 16S rRNA -geenin sekvensointi?
- Mitä on shotgun-metagenomisekvensointi?
- 16S/ITS-sekvensointi vs. shotgun-metagenomisekvensointi
- Taksonomian resoluutio
- Funktionaalinen profilointi
- Mikrobien kattavuus ja suositeltu näytetyyppi
- Väärät positiiviset tulokset
- Isäntä-DNA:n häiriöt
- DNA:n syöttö
- Here to Help
- Ota selvää, mikä sekvensointimenetelmä sopii sinulle parhaiten. Keskustele ZymoBIOMICS-sekvensointipalveluita tarjoavien asiantuntijoiden kanssa.
Kumman valita mikrobiomitutkimuksiin
16S sekvensointi vai shotgun sekvensointi? Lähes kaikki mikrobiomitutkijat esittävät itselleen tämän kysymyksen uutta tutkimusta suunnitellessaan, koska valtaosassa mikrobiomijulkaisuista käytetään joko 16S rRNA -geenin sekvensointia tai shotgun-metagenomista sekvensointia tuottamaan raakadataa myöhempiä mikrobien profilointi- tai metagenomianalyysejä varten. Kummallakin menetelmällä on hyvät ja huonot puolensa, joten kumpi menetelmä kannattaa valita?
Mitä on 16S rRNA -geenin sekvensointi?
16S rRNA -geenin sekvensoinnissa tai yksinkertaisesti 16S-sekvensoinnissa hyödynnetään PCR:ää, jolla kohdennetaan ja monistetaan osia bakteerien 16S rRNA -geenin hypervariaabeleista alueista (V1-V9)1. Erillisistä näytteistä saadut amplikonit varustetaan molekyyliviivakoodeilla, yhdistetään ja sekvensoidaan. Sekvensoinnin jälkeen raakadata analysoidaan bioinformatiikkaputkella, joka sisältää trimmauksen, virheiden korjauksen ja vertailun 16S-referenssitietokantaan. Kun lukemat on luokiteltu fylogeneettisesti, voidaan luoda taksonominen profiili. Vastaavasti ITS-sekvensoinnissa noudatetaan samaa strategiaa, mutta se kohdistuu sienien genomissa esiintyvään ITS-alueeseen (Internal transcribed spacer).
Mitä on shotgun-metagenomisekvensointi?
Toisin kuin 16S-sekvensoinnissa, joka kohdistuu vain 16S rRNA-geeneihin, shotgun-metagenomisekvensoinnissa sekvensoidaan kaikki näytteen genominen DNA. Kirjaston valmistelun työnkulku on samanlainen kuin tavallisessa koko genomin sekvensoinnissa, mukaan lukien satunnainen fragmentointi ja adapteriligaatio. Tyypillinen työnkulku shotgun-metagenomisen datan taksonomian analysoimiseksi sisältää laadun trimmauksen ja vertailun referenssitietokantaan, joka sisältää kokonaisia genomeja (esim. Kraken2 ja Centrifuge3) tai valittuja merkkigeenejä (MetaPhlAn4 ja mOTU5) taksonomiaprofiilin luomiseksi. Koska shotgun-metagenomisekvensointi kattaa näytteen kaiken geneettisen informaation, tietoja voidaan käyttää lisäanalyyseihin, esim. metagenomiseen kokoamiseen ja yhdistämiseen, metabolisen toiminnan profilointiin ja antibioottiresistenssigeenien profilointiin.
16S/ITS-sekvensointi vs. shotgun-metagenomisekvensointi
Jos tutkimuksesi edellyttää taksonomisen profiloinnin lisäksi muita genomianalyysejä, kuten metabolisten polkujen analyysiä, kannattaa harkita shotgun-metagenomisekvensointia sen suuremman genomisen kattavuuden ja suuremman datatuotoksen vuoksi. Jos koostumuksen profilointi on tutkimuksen päätarkoitus, molemmilla tekniikoilla on hyvät ja huonot puolensa, jotka on otettava huomioon (taulukko 1).
Taksonomian resoluutio
16S/ITS-sekvensoinnin taksonomian resoluutio riippuu kohteena olevista muuttuvista alueista, organismista itsestään ja sekvenssianalyysin algoritmista. Viime vuosina eräät virheenkorjausmenetelmät, esimerkiksi DADA26 , ovat parantaneet huomattavasti tämän tekniikan tarkkuutta ja taksonomian resoluutiota. DADA2:n avulla monien organismien lajitason resoluutio tavallisella 16S-sekvensoinnilla on nyt todellisuutta. Teoriassa shotgun-metagenomisekvensoinnilla voidaan kuitenkin saavuttaa kantatason resoluutio, koska sillä voidaan kattaa kaikki geneettiset variaatiot. Käytännössä kantatason resoluution tarkkuuteen liittyy kuitenkin edelleen teknisiä haasteita. Siitä huolimatta shotgun-metagenomisekvensoinnilla saavutetaan korkeampi resoluutio kuin 16S/ITS-sekvensoinnilla.
Funktionaalinen profilointi
Jos tavoitteena on aineenvaihdunnan funktionaalinen analyysi, useimmat tutkijat unohtavat nopeasti 16S- ja ITS-sekvensoinnin. On kuitenkin olemassa joitakin työkaluja, joilla voidaan päätellä metabolista toimintaa taksonomiatiedoista, esim. PICRUSt7. Mutta yleisesti ottaen shotgun-metagenomisekvensointia hyödynnetään usein silloin, kun tarvitaan funktionaalista profilointia ylimääräisen geenipeiton vuoksi.
Mikrobien kattavuus ja suositeltu näytetyyppi
Shotgun-sekvensoinnissa tutkitaan koko metagenomista DNA:ta, kun taas 16S-sekvensoinnissa tutkitaan vain 16S- rRRNA-geenejä, mikä kärsii myös epätäydellisestä alukkeiden peitosta. Näin ollen ensiksi mainitulla on suurempi poikkihallinnollinen kattavuus. Miksi sitten taulukossa 1 ilmoitetaan, että 16S/ITS-sekvensointi kattaa paremmin bakteerit ja sienet? Tämä johtuu käytettävissä olevien viitetietokantojen lajipeitosta, koska näiden sekvensointimenetelmien taksonominen ennuste riippuu suuresti käytetystä viitetietokannasta. Tällä hetkellä 16S/ITS-tietokantojen kattavuus on paljon parempi kuin koko genomin tietokantojen. Tämä johtuu siitä, että ihmisen mikrobiomiin liittyvien mikrobien kokonaiset genomit on tutkittu paljon paremmin kuin muihin ympäristöihin liittyvien mikrobien genomit. Tämän vuoksi on suositeltavaa käyttää shotgun-metagenomisekvensointia ihmismikrobiomiin liittyvissä näytteissä, kuten ulosteissa ja syljessä, jos taksonomian profilointi on päätarkoitus.
Lisäksi metagenomisekvensoinnissa on suurempi riippuvuus vertailutietokannasta. Jos esimerkiksi bakteerilla ei ole läheistä sukua olevaa edustajaa 16S-referenssitietokannassa, se voidaan ehkä tunnistaa korkeammalla fylogeneettisellä tasolla tai tuntemattomaksi bakteeriksi. Jos bakteerilla ei kuitenkaan ole lähisukulaista (samaan sukuun kuuluvaa genomia) referenssigenomitietokannassa, haulikkometagenomisekvensoinnissa bakteeri jää todennäköisesti kokonaan tunnistamatta. Esimerkiksi ZymoBIOMICS Spike-in Control I sisältää kaksi ihmisen mikrobiomille vierasta mikrobia (Imtechella halotolerans ja Allobacillus halotolerans), joiden genomeja ei aiemmin ollut saatavilla. Jos sitä lisätään ulostenäytteeseen ja sekvensoidaan haulikkosekvensoinnilla, useimmat bioinformatiikkapipelit jättävät ne kokonaan huomiotta, ellei näitä kahta genomia lisätä manuaalisesti viitetietokantaan. Toisaalta, jos ne analysoidaan 16S-sekvensoinnilla, ne tunnistetaan, koska niiden 16S-sekvenssi on olemassa viitetietokannoissa.
Väärät positiiviset tulokset
Virheenkorjaustyökalut, kuten DADA2, parantavat 16S/ITS-sekvensoinnin taksonomisen resoluution lisäksi myös tarkkuutta. Tämä on osoitettu sekvensoitaessa DNA:ta mock-mikrobiyhteisöstä (esim. ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Kaikki 16S-sekvenssit saadaan talteen ilman virheitä sekvenssissä, eli ei vääriä positiivisia tuloksia. Mutta haulikkometagenomisekvensoinnissa, ellei referenssitietokannassa ole täydellistä edustavaa genomia sekvensoitavalle mikrobille, bioinformatiikan analyysi todennäköisesti ennustaa useiden ”läheisesti sukua olevien” genomien olemassaoloa. Nämä läheisesti sukua olevat genomit voivat olla saman suvun eri lajeista tai jopa eri suvuista. Oletetaan esimerkiksi, että on olemassa kolme läheisesti sukua olevaa mikrobia, A, B ja C, joilla on joitakin yhteisiä sekvenssejä. Laji A jakaa joitakin sekvenssejä vain B:n kanssa ja joitakin muita sekvenssejä vain C:n kanssa. Jos viitetietokannassa on vain B:n ja C:n genomeja, kun A:n sekvensointi suoritettiin, bioinformatiikka ennustaa, että sekä B että C ovat läsnä. Esimerkiksi sekä A että B voivat olla Escherichia coli -bakteerin kantoja ja C Salmonella enterica -bakteerin kantoja; B:n ja C:n yhteiset sekvenssit voivat olla peräisin horisontaalisesta geeninsiirrosta, joka on yleistä läheisesti sukua olevien mikrobien välillä. Tämän vuoksi 16S/ITS-sekvensointi on parempi väärien positiivisten tulosten suhteen.
Isäntä-DNA:n häiriöt
Lisäisen isäntä-DNA:n läsnäolo voi aiheuttaa epäspesifistä monistumista 16S- ja ITS-sekvensoinnin kirjastonvalmistusprosessissa, mutta vaikutus on hallittavissa säätämällä PCR-syklejä ja vaihtamalla alukkeita. Toisaalta isäntä-DNA:n aiheuttama häiriö on paljon vaikeampi ongelma shotgun-metagenomisessa sekvensoinnissa, vaikka sekvensoinnin kustannukset ovatkin laskeneet dramaattisesti. Näytetyypistä riippuen jotkin näytteet voivat sisältää >99 % ihmisen isäntä-DNA:ta, mikä paitsi lisää sekvenssikustannuksia myös tuo epävarmuutta mittaukseen. Tämän vuoksi monet tutkijat tarkastelevat isäntä-DNA:n tyhjentämistä, esim. HostZERO Microbial DNA Kit, ennen shotgun-sekvensoinnin kirjaston valmistelua. Mikrobien genomista DNA:ta ei kuitenkaan välttämättä ole jäljellä tarpeeksi shotgun-sekvensointia varten isäntä-DNA:n poiston jälkeen, joka yleensä edellyttää vähintään 1 ng:n panosta. Isäntä-DNA:n häiritsevyys on syy siihen, miksi matalaa haulikkosekvensointia suositellaan vain ihmisen ulostenäytteille.
DNA:n syöttö
Vaikka haulikkometagenomisekvensointi vaatii vähintään 1 ng DNA:n syöttöä, 16S/ITS-sekvensointi on paljon herkempi, ja syöttöminimit ovat femtogrammoja tai jopa niinkin alhaisia kuin 10 kopiota 16S rRNA-geeneistä.
Here to Help
Valinta 16S-sekvensoinnin ja shotgun-metagenomisen sekvensoinnin välillä on kriittinen vaihe kaikissa mikrobiomitutkimuksissa. Budjetin lisäksi on otettava huomioon monia hankkeen näkökohtia, kuten näytetyyppi, halutut analyysit, taksonomian resoluutio ja kohdeorganismit. Näiden seikkojen huomioon ottaminen auttaa sinua valitsemaan oikean sekvensointimenetelmän seuraavaa mikrobiomiprojektiasi varten. ZymoBIOMICSin mikrobiomin sekvensointipalvelut tarjoavat 16S-, ITS- ja shotgun-sekvensointia täydellisinä palveluina DNA:n louhinnasta sekvensointiin ja bioinformatiikkaan. Zymo Researchin sekvensoinnin ja bioinformatiikan asiantuntijat auttavat sinua mielellään valitsemaan oikean sekvensointimenetelmän tutkimukseesi.
Ota selvää, mikä sekvensointimenetelmä sopii sinulle parhaiten. Keskustele ZymoBIOMICS-sekvensointipalveluita tarjoavien asiantuntijoiden kanssa.
Lisätietoja
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Next-Generation Metagenomics: Methodological Challenges and Opportunities. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: ultranopea metagenominen sekvenssiluokittelu käyttäen tarkkoja linjauksia. Genome Biology 2014 15(3): R46.
3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuge: metagenomisekvenssien nopea ja herkkä luokittelu. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. Sunagawa S, et al. Metagenomic species profiling using universal phylogenetic marker genes. Nature Methods 2013 10(12): 1196-1199.
6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: Korkean resoluution näytteen päättely Illumina-amplikonidatasta. Nature Methods 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology 2013 31(9): 814-821.
13. marraskuuta 2019.