Antisense-oligonukleotidit, jotka on kohdistettu SMN2:een
ASO:t ovat yksijuosteisia nukleiinihappoja, jotka on syntetisoitu niin, että ne ovat komplementaarisia kohteena olevaan RNA:n sekvenssiin. Kun ASO on annosteltu, se kulkeutuu soluun toistaiseksi huonosti määritellyn endosyyttisen mekanismin kautta ja kulkeutuu sitten tumaan, jossa se sitoutuu kohteensa pre-mRNA:han.62 Alun perin ASO:ita käytettiin geeniekspression tukahduttamiseen joko estämällä RNA-kohteen translaatio tai edistämällä sen hajoamista. Nykyään ASO:t voidaan suunnitella myös muuttamaan kohteen prosessointia tai splikointia. SMA:n terapeuttiset ASO:t on suunniteltu muuttamaan SMN2:n pre-mRNA:n muuttuvaa splikointia siten, että eksoni 7 sisältyy lopulliseen prosessoituun transkriptiin. Kuten aiemmissa luvuissa käsiteltiin, SMN2 eroaa SMN1:stä C:stä T:ksi siirtymällä, joka tapahtuu kuusi nukleotidia eksonissa 7 (näiden kahden sekvenssin välillä on muitakin eroja, mutta tämä on toiminnallisesti tärkein). C-T-siirtymä luo eksoniin 7 laajennetun inhiboivan kontekstin (tunnetaan myös nimellä ”Exinct”).63 Koska eksoni 7 on muutoin heikosti määritelty heikon 5′-liitoskohdan vuoksi, SMN2:n C-T-mutaatio riittää kallistamaan tasapainon sen sisällyttämisestä poissulkemiseen.
Lisäyksen säätelyelementit ovat tärkeässä roolissa määriteltäessä sitä, mitkä kohdat solun spleikkauskoneisto tunnistaa. Merkityksellisten SMN2:n elementtien sijainti ja toiminta tunnistettiin analysoimalla SMN2:n sekvenssiä täydentämään suunniteltujen ASO:iden laajan sarjan spleikkausvaikutusta asteittain iteratiivisesti.63-66 Introninen spleikkauksen vaimentaja ISS-N1 tunnistettiin erittäin tehokkaaksi vaimentavaksi elementiksi tällä menetelmällä; motiivi sijaitsee eksoni 7:n 5′-spleikkauskohdan alapuolella ja sitoutuu spleikkauksen repressoriin hnRNP A1:een.66-68 ASO:t on suunniteltu niin, että ne indusoivat eksoni 7:n sulkeutumisen luotettavasti kohdistamalla ne ISS-N1:een tai muihin säätelijäelementteihin.
ASO:t voidaan suunnitella bifunktionaalisiksi. Esimerkiksi kimeeristen ASO:iden, jotka fuusioivat SR-rekrytointidomeenit (RS-peptidi) antisense-sekvenssiin, joka tukahduttaa silencer-motiiveja, on osoitettu lisäävän eksoni 7:n inkluusiota ja SMN-proteiinipitoisuuksia potilaan fibroblasteissa; bifunktionaalisen ASO:n yksittäinen injektio pystyi indusoimaan SMN-proteiinia vastasyntyneiden hiirten aivoissa ja pidentämään elinikää.65,69 Tätä ASO:n suunnittelustrategiaa, joka tunnetaan nimellä ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors), käytettiin alun perin SMA:n terapeuttisessa hoidossa, mutta myöhemmät tutkimukset osoittivat, että RS-peptidi ei ollut välttämätön vahvan vaikutuksen aikaansaamiseksi SMN2:n eksoni 7:n sisällyttämiseen. Koska kimeerinen lähestymistapa aiheuttaa vaikeuksia ASO:n valmistuksessa ja rajoittaa ASO:n solujen läpäisevyyttä, bifunktionaalisia ASO:ita ei ole testattu laajasti hiirillä, eikä niitä tällä hetkellä kehitetä kliinisesti.62
Kun ISS-N1:een kohdistuvien ASO:iden osoitettiin edistävän eksoni 7:n inkluusiota hämmästyttävän tehokkaasti, seuraavana strategisena kysymyksenä oli sen määrittäminen, minkälaista ASO:n selkärankaa olisi parasta käyttää potentiaalisessa SMA-tautien hoidossa. ASO:n muodostavia oligonukleotideja muokataan tyypillisesti farmaseuttisten ominaisuuksien, kuten soluun imeytymisen, toksikologian, farmakokinetiikan ja kohdesitoutumisen, optimoimiseksi. Yleinen mukautus, joka syntyi Ciba-Geigy Ltd.:n ja Ciba-Geigy Ltd.:n välisen yhteistyön tuloksena. (nykyisin Novartis) ja Isis Pharmaceuticals (nykyisin Ionis Pharmaceuticals), on 2′-O-metoksietyyli (2′-MOE), joka lisää sekä ASO:n vastustuskykyä nukleaasin hajoamiselle että hybridisaatioaffiniteettia.70 2′-MOE-oligonukleotidit ovat osoittautuneet erittäin turvallisiksi jyrsijöillä ja kädellisillä eläimillä, mukaan lukien ihmisillä.62 ISS-N1:n salpaavan 2′-MOE-ASO:n antaminen lisäsi onnistuneesti SMN2:n eksoni 7:ää annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla SMA-hiirillä, mikä paransi neuromuskulaarista patologiaa ja lisäsi merkittävästi eloonjäämisikää.68,71,72 Ionis Pharmaceuticals kehittää yhteistyössä Biogenin kanssa 2′-MOE-ASO-hoitoa, jonka nimi on nusinerseeni (joka tunnetaan myös nimellä IONIS-SMNRx ja jota aiemmin kutsuttiin nimellä ISIS-SMNRx). Kädellisillä kädellisillä tehdyt prekliiniset tutkimukset nusinerseenillä osoittivat, että yksittäinen intratekaalinen injektio voi johtaa kudospitoisuuksiin, jotka ovat välttämättömiä merkittävien parannusten aikaansaamiseksi eksoni 7:n sulkeutumisessa, ja nämä pitoisuudet pysyivät yllä useiden kuukausien ajan62. Lääkkeen pitkä puoliintumisaika tarkoittaa, että potilaat saattavat tarvita intratekaalisen injektion vain muutaman kuukauden välein.73 Vaiheen 1 avoimessa tutkimuksessa, joka tehtiin SMA-tyypin II/III potilailla, jotka olivat iältään 2-14-vuotiaita, nusinerseenin yksittäinen injektio oli hyvin siedetty, ja se näytti korreloivan HFMSE-pisteiden kohoamiseen suurimmalla annostuksella.74 Kesäkuussa 2015 Ionis julkaisi uusia tietoja meneillään olevasta avoimesta nusinerseenin vaiheen 2 tutkimuksesta tyypin I pikkulapsilla, jotka osoittivat, että pikkulapset elivät pidempään ja saavuttivat enemmän motorisia virstanpylväitä kuin mitä tavallisesti odotettaisiin taudin luonnollisen historian perusteella.75 Lisäksi lääkkeen vaikutusmekanismia tukivat tiedot, jotka osoittivat, että hoitoa saaneiden potilaiden ruumiinavausnäytteistä otetuissa aivo- ja selkäydinkudoksissa oli havaittavissa SMN2:n täysipitkä SMN2:n mRNA:n ja SMN-proteiinien määrän lisääntymistä. Ionis julkaisi myös tietoja tyypin II/III SMA:ta sairastavilla lapsilla tehdystä vaiheen 2 avoimesta jatkotutkimuksesta, jonka mukaan 57 prosenttia tutkittavista saavutti vähintään kolmen pisteen parannuksen HFMSE-testissä ja keskimäärin 55 metrin parannuksen 6 minuutin kävelytestissä (6MWT).76 Nusinersenillä tehdään parhaillaan vaiheen 3 tutkimuksia sekä SMA:ta sairastavilla lapsilla että aikuisilla (NCT02193074; NCT02292537); tulosten pitäisi olla saatavilla vuonna 2017.
Vaikka 2′-MOE:n käytöllä SMA:n hoidossa ei ole toistaiseksi havaittu turvallisuusongelmia, 2′-MOE:n ASO-valmisteisiin on liittynyt joitakin toksisuuksia muissa potilasryhmissä.77,78 Toinen selkärangan modifikaatio, jota tutkitaan käytettäväksi SMA:n hoidossa ja jolla voidaan kiertää nämä ongelmat, on fosforoamidaattimorfolinooligomeerit (PMO). PMO:iden on osoitettu olevan tehokkaampia kuin 2′-MOE hiirimalleissa, joissa esiintyy Duchennen lihasdystrofiaa (DMD), toista lasten neuromuskulaarista sairautta, ja ne olivat myös hyvin siedettyjä DMD-potilailla.79 ISS-N1:tä täydentävien morfolino-ASO:iden ICV-injektio paransi SMA-hiirten eloonjäämisikää merkittävästi ilman merkkejä keskushermostotoksisuudesta (CNS).80,81,81 ISS-E1:een, eksoni 7:n ylävirtaan sijaitsevaan introniseen splikoinnin vaimentajaan, kohdistettu morfolino parantaa myös SMA-hiirten fenotyyppiä.82 Tätä lähestymistapaa ei ole vielä otettu käyttöön kliinisessä tutkimuksessa.
ASO:n selkärangan kemia voi vaikuttaa soveltuvuuteen erilaisiin levitysmenetelmiin, toistuvan annostelun tarpeellisuuteen ja siihen liittyviin toksisuuksiin, millä kaikella on merkittävää vaikutusta sen terapeuttiseen käyttöön. Lisäksi SMA:n hoitoon käytettävän ASO:n on pysyttävä farmakologisesti aktiivisena keskushermoston kudoksissa, erityisesti liikehermosoluissa. SMA:n hoitoon suunniteltu ASO on selkärangasta riippumatta todennäköisesti annettava suoraan aivo-selkäydinnesteeseen intratekaalisen injektion avulla. Vaikka jotkin tutkimukset, joissa vastasyntyneille hiirille annettiin perifeeristä ASO:ta, osoittivat tehoa, veri-aivoeste ei ole täysin muodostunut nuorilla hiirillä, ja perifeerisesti annosteltu ASO pystyy tunkeutumaan keskushermostoon siinä määrin kuin se ei ole mahdollista ihmisillä.71 Ilahduttavaa on, että intratekaalisesti injektoitujen ASO:iden on osoitettu jakautuvan laajalti tärkeisiin keskushermostoon kuuluviin kudoksiin, kuten liikehermoston hermosoluihin, astrosyytteihin ja mikroglioihin.72,83-85
Vaikka intratekaalinen injektio on jossain määrin invasiivinen ja vaatii sedaatiota tai anestesiaa, ASO-yhdisteillä on useita merkittäviä etuja muihin kokeellisiin menetelmiin verrattuna, mukaan lukien korkea kohdespesifisyys, huomattava teho, vähäinen toksisuus verrattuna ASO-yhdisteiden systeemiseen annosteluun ja suhteellisen yksinkertaiset valmistusprosessit verrattuna biologisiin aineisiin (mutta ei pieniin molekyyleihin). Lisätietoja on luvussa 18.
.