Bulk RNA-seq -datan standardit ja käsittelyputkisto

Katsaus putkistoon

Bulk RNA-seq -putkisto kehitettiin osana ENCODE Uniform Processing Pipelines -sarjaa. Täydellinen putkikoodi on vapaasti saatavilla Githubissa, ja sitä voi käyttää DNAnexuksessa (linkki edellyttää tilin luomista) sen nykyisellä hinnoittelulla.

EnCODE Bulk RNA-seq -putkistoa voidaan käyttää sekä monistetuille että monistamattomille, parittaisille tai yksipäisille sekä säikeispesifisille tai ei-säikeispesifisille RNA-seq-kirjastoille. Kirjastot on tuotettava mRNA:sta (poly(A)+, rRNA:sta köyhdytetystä kokonais-RNA:sta tai poly(A)-populaatioista, joiden koko on valittu siten, että ne ovat pidempiä kuin noin 200 bp. Tulevaisuudessa tätä putkea voidaan käyttää myös PAS-seq- ja Bru-seq-datan käsittelyyn.

Putkilinjan kaavio pareittain erotetuille datoille

Katsele tämän putkilinjan tämänhetkistä instanssia pareittain erotetuille datoille

Putkilinjan kaavio yksittäispäätteisille datoille

Katsele tämän putkilinjan tämänhetkisiä instansseja yksittäispäätteisiä datoja varten

>>

Syötteet:

Tiedostomuoto	Tiedoston sisältämät tiedot	tiedosto. description	Notes
fastq	reads	G-zipped bulk RNA-seq reads	Lukujen on täytettävä Uniform Processing Pipeline Restrictions -kohdassa esitetyt kriteerit.
tar	genomi-indeksi	Generated by STAR or TopHat	Katsokaa ”Outputs”-taulukon alapuolella olevasta kohdasta ”Regarding alignment and quantification” (Kohdistus ja kvantitatiivisuus) lisätietoa kohdistusohjelmista (alignerit) ja niiden indekseistä.
fasta	spike-in-sekvenssi	ERCC Spike-ins (External RNA Control Consortium)	Spike-ins ovat käytännössä RNA-seq-kokeen kontrolleja.

Tulokset:

.

Tiedoston muoto	Tiedoston sisältämät tiedot	Tiedoston kuvaus	Notes
bam	alignmentit	Tuotetaan kartoittamalla lukemat genomiin.	Katsokaa kohdasta ”Kohdistamisen ja kvantifioinnin osalta” ”Tuotokset”-taulukon alapuolella lisätietoja kohdistimista ja niiden indekseistä.
bam	transkriptomikohdistukset	Tuotetaan kartoittamalla lukuja transkriptomiin.
bigWig	signal	Normalisoitu RNA-seq-signaali	Signaalit tuotetaan yksikäsitteisille lukusuureille ja yksikäsitteisille+multimapping-lukusuureille sekä plus- että miinussäikeissä. Ei-juosteiselle aineistolle signaalit luodaan uniikeille lukemille ja uniikeille+multimapping-lukemille ottamatta huomioon juosteen identiteettiä.
tsv	geenien kvantifioinnit	Sisältää spike-ins-kvantifioinnit	Tiedostomuodon spesifikaatiot ovat seuraavat: sarakkeessa 1: gene_id sarakkeessa 2: transkripti_id(s) sarakkeessa 3: length sarake 4: effective_length sarake 5: expected_count sarake 6: TPM (transcripts per million) sarake 7: FPKM (fragments per kilobase of transcript per million) sarake 8: posterior_mean_count sarake 9: posterior_standard_deviation_of_count sarake 10: pme_TPM sarake 11: pme_FPKM sarake 12: TPM_ci_lower_bound sarake 13: TPM_ci_upper_bound sarake 14: FPKM_ci_lower_bound sarake 15: FPKM_ci_upper_bound
tsv	transkriptien kvantifioinnit	Sisältää spike-insin kvantifioinnit	Katsokaa transkriptien kvantifiointeja koskeva varoitus alla olevassa kappaleessa otsikolla ”Kohdistamisen ja kvantifioinnin osalta”.
Putkisto tuottaa myös laatumittareita, kuten Spearmanin korrelaatio ja lukusyvyys.

Kohdistamisesta ja kvantifioinnista:

Lukulukujen kartoitus tehdään STAR-ohjelmalla (joissakin tapauksissa käytetään sekä STAR- että TopHat-alignaattoreita erillisten bam-tiedostojen tuottamiseksi) ja geenien ja transkriptien kvantifiointi tehdään RSEM-ohjelmalla. Vaikka eri RNA-seq-putkistojen tuottamat kartoitukset ja geenien kvantifioinnit ovat yleisesti ottaen yhteneväisiä, yksittäisten transkriptien isoformien kvantifioinnit ovat paljon monimutkaisempia, ja ne voivat vaihdella huomattavasti käytetystä prosessointiputkistosta riippuen, eikä niiden tarkkuutta tunneta. Siksi kohdistuksia ja geenien kvantifiointeja voidaan käyttää luottavaisin mielin, kun taas transkriptien kvantifiointeja on käytettävä varoen.

Genomiviitteet

Katsele tässä putkistossa käytettyjä genomiviitteitä ja kromosomikokoja

Nämä putkistot vaativat sekä kokoonpanotietoja kiinnostuksen kohteena olevasta lajista että geeniviitteen. Kukin pääohjelmista, TopHat, STAR ja RSEM, luo indeksin käytettäväksi seuraavissa vaiheissa. Lisätietoja RSEM:n käytöstä on saatavilla täältä.

Exogeeniset RNA-spike-in-kontrollit

Exogeeniset RNA-spike-in-kontrollit lisätään näytteisiin vakiomuotoisen perusviivan luomiseksi RNA-ekspression kvantifiointia varten (PMC3166838). ENCODE-konsortio standardoi käyttämään kaupallisesti saatavilla olevia Ambion Mix 1 -spike-in-kontrolleja laimennoksella, joka on ~2 % lopullisista kartoitetuista lukemista. Käytössä on kuitenkin sekoitus vanhempaa dataa ja tuotua dataa. Siksi tietyssä kirjastossa käytettyjen spike-inien seuraamiseksi kirjastoon on liitetty tietokokonaisuus. Kyseinen tietokokonaisuus sisältää spike-ins-sekvenssitiedoston fasta-muodossa ja tiedot konsentraatioista. Näiden spike-in-sekvenssien odotetaan löytyvän kartoitusvaiheessa (-vaiheissa) käytetystä genomi-indeksistä ja myöhemmin luodusta bam-tiedostosta. Sekvenssien kvantifioinnit löytyvät RSEM:n transkripti- ja geenikvantifiointitiedostoista.

Katsele spike-ins-tietoaineistoja
Katsele ERCC:n spike-ins-analyysin todistusta
KäyTTää ERCC:n dash boardia

Linkit ja julkaisut

Löydä tällä putkiputkiprosessilla tuotettuja tietoja:
Tutustu julkaisuihin (tekeillä)

Katsele julkaisuja (työn alla)