Tulokset ja keskustelu
Kirjoituksessa Jiang et al. kuvailtu ”autofaginen virtaus” on kvantitatiivinen vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP:tä) sisältävä raportoiva määrityslaji, joka mittaa ratiometrisiä muunnoksia moniarvoisesta polyQ GFP:n ja vapaan GFP:n välille Western blot -analyysin avulla. Multicistroninen raportointikonstruktio suunniteltiin koodaamaan kahta proteiinia; N-terminaaliseen GFP:hen sidottua polyQ:ta ja vapaata GFP:tä. Viruksen 2A-sekvenssi (v2A) sijoitettiin linkkialueeksi kahta proteiinia koodaavien sekvenssien väliin, jotta mahdollistetaan kahden erillisen proteiinin stoikiometrinen translaatio yhdestä avoimesta lukukehyksestä (kuva 1a) .
Putatiivisten Q52-, Q31- ja Q10-GFP-konstruktioiden tuottaminen Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP-multikistronisen reportterikonstruktion avulla. a Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP-konstruktioon liittyvä vektorikartta. b Yhteenveto CAA- ja CAG-degeneraattisten koodonien käytöstä kyseisessä konstruktiossa. c Konstruktiosta tehty kromatografia, jossa näkyvät satunnaisesti väliin sijoittuvat glutamiinia koodaavat CAG- ja CAA-tripletit. d Kaaviokuva Q80-GFP:tä sisältävän konstruktion PCR-pohjaisesta poissulkevasta monistamisesta sellaisten polyQ-konstruktioiden tuottamiseksi, joissa on vähemmän glutamiinitoistoja. e Q80-sekvenssi, jossa näkyvät Q52-, Q31- ja Q10-alukkeiden sitoutumiskohdat. f Q52-, Q31- ja Q10-konstruktioiden tuottamiseen tarkoitettujen alukkeiden sekvenssit. g Analyyttinen agaroosigeelielektroforeesi kullekin oletetulle Q80-, Q52-, Q31- ja Q10-vektorille käyttäen polyQ-aluetta reunustavia alukkeita. PCR-tuotteiden koot olivat ~ 270, ~ 180, ~ 120 ja ~ 60 bp suunnitelluille oletetuille Q80-, Q52-, Q31- ja Q10-GFP-konstruktioille
Suunnittelimme polyQ-sekvenssin, joka sisälsi 80 glutamiinitoistoa (Q80). Sekvenssi suunniteltiin siten, että toistojen samankaltaisuus on vähäinen, kun glutamiinia koodaavat CAG-tripletit ja glutamiinia koodaavat CAA-tripletit lomittuvat satunnaisesti (Kuva 1b, c). Nukleotidikorvaukset tehtiin silmämääräisesti puoliksi satunnaisen kuvion luomiseksi. Tämän ei-toistuvan sekvenssisuunnittelun pitäisi lisätä sekvenssin stabiilisuutta bakteereissa tapahtuvan lisääntymisen aikana, mutta se mahdollisti myös sellaisten PCR-alkuaineiden suunnittelun, jotka kiinnittyivät sekvenssin tiettyihin alueisiin.
Yllä kuvattu Q80-GFP-v2A-GFP-konstruktio syntetisoitiin kaupallisesti (Biomatik Corporation) (ks. lisätiedosto 1) ja sub-kloonattiin BamHI- ja ClaI-rajoituskohtien kautta Tol2-transposoniin perustuvaan pT2AL200R150G-geeninsiirtovektoriin (jäljempänä Tol2), joka on saatavissa Kawakamin laboratoriosta (kuva 1). 1a ja ks. lisätiedosto 2).
PolyQ-konstruktiot, joissa on vähemmän glutamiinitoistoja, tuotettiin PCR-pohjaisella poissulkevalla monistuksella Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP-konstruktiosta. Alukkeet suunniteltiin niin, että ne monistuvat vektorin ympärillä, joka sulkee pois määritellyn määrän glutamiinitoistoja, kiinnostavien konstruktioiden tuottamiseksi (Kuva 1d-f). Pyrimme tuottamaan vektoreita, joissa oli noin 52 (Q52), 31 (Q31) ja 10 (Q10) glutamiinitoistoa. Oletetut Q52- ja Q31-vektorit tuotettiin käyttämällä samaa käänteisaloitinta yhdistettynä eri eteenpäin suuntautuviin alukkeisiin. Tämä yhteinen käänteisaloitin monisti 2 glutamiinin toistoa, kun taas eteenpäin suuntautuvat alukkeet monistivat ylimääräiset 50 ja 29 glutamiinin toistoa, joita tarvittiin Q52- ja Q31-vektoreiden tuottamiseen. Käänteisen alukkeen paikkaa siirrettiin hieman oletetun Q10-vektorin monistamisen optimoimiseksi siten, että käänteinen aluke monisti nyt 5 glutamiinitoistoa, kun taas etummainen aluke monisti loput 5 glutamiinitoistoa (kuva 1d-f). Käyttämällä PCR-reaktiossa tiukkoja hehkutuslämpötiloja saatiin aikaan spesifinen alukkeen sitoutuminen. Geeliuutetut ja puhdistetut PCR-tuotteet fosforyloitiin, sirkularisoitiin itseligatoinnilla ja transformoitiin sen jälkeen kompetentteihin soluihin (ks. lisätiedosto 3). PCR, jossa käytettiin polyQ-aluetta reunustavia alukkeita, osoitti suunnilleen odotetun kokoisia tuotteita aiotuille oletetuille Q52-, Q31- ja Q10-vektoreille (kuva 1g). Muodostetut konstruktiot sekvensoitiin sen määrittämiseksi, esiintyivätkö odotetut polyQ-toistoluvut. Vaikka Q52-konstruktiossa oli odotettu määrä glutamiinitoistoja (kuvat 2a, b), sekvensointi paljasti vähäisiä poikkeamia odotettuihin polyQ-lukuihin nähden kahden muun konstruktion osalta: Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP-vektorissa oli 21 glutamiinitoistoa (jäljempänä Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (kuvat 2a, b). 2c, d) ja Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP-vektorissa oli 11 glutamiinitoistoa (jäljempänä Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (kuvat 2e, f). Tarkempi analyysi osoitti, että tuotettu Q21-sekvenssi oli peräisin suoraan alkuperäisestä sekvenssistä ja että glutamiinitoistojen häviäminen johtui siitä, että Q31-alkuaine sitoutui 30 bp:n päässä ennustetusta sitoutumiskohdasta. Sitä vastoin Q11-sekvenssin ylimääräinen glutamiinitoisto syntyi de novo, CAA-kodonin lisäys.
Vektorikartta ja sekvenssianalyysi Q52-, Q21- ja Q11-GFP:tä koodaavista konstruktioista, jotka on tuotettu PCR:ään perustuvalla excision amplifikaatiolla. a Vektorikartta Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP-konstruktiosta. b Kromatografia Q52-konstruktiosta. c Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP-konstruktion vektorikartta. d Q21-konstruktion kromatografia. e Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP-konstruktion vektorikartta. f Q11-konstruktion kromatografia
Tutkiaksemme polyQ-proteiinin aggregaatiokinetiikkaa ja ”autofagista virtausta” in vivo, ruiskutimme tuotettuja polyQ-vektoreita (25 ng/μL) ja transposaasi-mRNA:ta (25 ng/μL) ryhmiin, jotka koostuivat yhden solun vaiheessa olevista seeprakalan alkioista (Kuva 3a, b). Jokaisesta ryhmästä tehtiin Western blot -analyysi anti-GFP-vasta-aineella 24 tuntia hedelmöittymisen jälkeen (hpf) alkioiden lyseaatista (10 alkiota näytettä kohti). Tyhjä Tol2-vektori (25 ng/μL) ja transposaasi-mRNA (25 ng/μL) injektoituja ja injektoimattomia alkioita käytettiin kontrolleina. PolyQ-konstruktioilla injektoidut alkiot tuottivat odotetusti kaksi anti-GFP-vasta-aineella havaittua kaistaa; polyQ:hen kiinnittynyt GFP (polyQ80-GFP ~ 48 kDa, polyQ52-GFP ~ 38 kDa, polyQ21-GFP ~ 33 kDa ja polyQ11-GFP ~ 31 kDa) ja vapaa GFP (~ 27 kDa) (kuva 3c). Jokaisessa polyQ-GFP-konstruktiota ilmentävässä alkionlysaatissa näkyi myös heikompi kaistale, jonka proteiinikoko oli suurempi ja joka vastasi täyspitkää polyQX-GFP-v2A-GFP-konstruktiota (polyQ80-GFP-v2A-GFP ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP ~ 60 kDa ja polyQ11-GFP-v2A-GFP ~ 58 kDa). Tämä kaistale edustaa ~ 10 % kokonaisproteiinista, joka käännetään yhdeksi täyspitkäksi proteiiniksi, kun käytetään v2A-sekvenssijärjestelmää. Q80-GFP:GFP-, Q52-GFP:GFP-, Q21-GFP:GFP- ja Q11-GFP:GFP-suhteet ovat vastaavasti ~ 5, ~ 4, ~ 2 ja ~ 1 (kuva 3d). Koska v2A-sekvenssi mahdollistaa polyQ-GFP- ja GFP-proteiinien stoikiometrisen kääntämisen, polyQ-GFP:GFP-suhteen pitäisi teoriassa olla 1. Havaitut suuremmat suhteet voivat viitata näiden proteiinien kertymiseen. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa kirjallisuuden kanssa, jossa on osoitettu, että polyQ-GFP-fuusiokonstruktiot, jotka sisältävät yli 19 glutamiinijäämää, kasautuvat transfektoiduissa soluissa pituudesta riippuvalla tavalla. Näiden havaintojen perusteella voimme päätellä, että Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-konstruktiomme tarjoavat hyödyllisen välineen ”autofagisen virtauksen” tutkimiseen in vivo toukkavaiheen seeprakalamallissa.
Analyysi Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-konstruktioiden ilmentymisestä D. reriossa. Seeprakalojen alkioihin injektoitiin 25 ng/µL Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-konstruktiota ja 25 ng/µL Tol2-transposaasia koodaavaa mRNA:ta. a Kirkkaakenttä- (ylimmät paneelit) ja fluoresenssikuvat (alimmat paneelit) vasemmanpuoleisesta näkymästä seeprakalojen alkioiden pää- ja vartalo-osista, jotka ilmentävät Q80-, Q52-, Q21- ja Q11-GFP-rakenteita, ~ 24 hpf. b Kirkkaakenttä- (yläpaneelit) ja fluoresenssikuvat (alapaneelit) vasemmanpuoleisesta näkymästä seeprakalojen alkioiden vartalon ja hännän alueista, jotka ilmentävät Q80-, Q52-, Q21- ja Q11-GFP:tä, ~ 24 hpf. c Western blot -analyysi Qx-GFP-konstruktioiden ilmentymisestä D. reriossa. Proteiinit eristettiin Q80-, Q52-, Q21- ja Q11-GFP-konstruktioita ilmentävistä ~ 24 hpf:n alkioista. Proteiinit erotettiin 10 % SDS-PAGE-geelillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kalvo tutkittiin anti-GFP-vasta-aineella. ”Tyhjässä” Tol2-vektorissa on ekspressoitunut GFP-geeni, joka korvataan konstruktion insertion aikana. d Western blot -kvantitatiivinen määritys. Western blotin kunkin numeroidun kaistan GFP-intensiteetti ja Qx-GFP:n ja vapaan GFP:n suhde esitetään
Tulokset
Johtopäätös
Johtopäätöksenä voidaan todeta, että tässä tutkimuksessa on löydetty vankka ja helposti omaksuttavissa oleva ratkaisu, jonka avulla voidaan tuottaa lähelle suunniteltua pituutta olevia polyQ-toistoja. Tarkkojen glutamiinitoistojen lukumäärien tuottamiseksi voidaan suorittaa myöhempiä monistuskierroksia muuttuneilla alukesekvensseillä. Lisäksi alukkeen pituutta voidaan kasvattaa alukkeen spesifisyyden lisäämiseksi templaattiin sitoutumisessa. Tekniikallamme on useita etuja verrattuna nykyisiin menetelmiin, joita käytetään toistuvien alueiden PCR-pohjaiseen monistamiseen, ja sillä pyritään minimoimaan epäspesifisten PCR-tuotteiden ja virheellisten toistojen syntyminen hyödyntämällä geneettisen koodin koodoniredundanssia synonyymisen DNA:n koodaussekvenssin luomiseksi, jossa toistoja on vähemmän. Lisäksi lähestymistapamme ei rajoitu polyQ-toistosekvenssien tuottamiseen, vaan se voidaan yleistää myös muiden nukleotiditoistosekvenssien tuottamiseen. Menetelmämme on lisäksi suhteellisen edullinen, sillä vain alkuperäinen polyQ80-GFP-v2A-GFP-konstruktio vaatii kaupallista synteesiä, jonka kustannukset riippuvat nukleotidiemäskohtaisesta hinnasta, pituudesta, puhtaudesta ja massasta. Kaikki muut tarvittavat materiaalit ovat molekyylikloonauksessa käytettäviä standardireagensseja. Yhteenvetona voidaan todeta, että kuvattu tekniikka tarjoaa helposti omaksuttavan ja kohtuuhintaisen ratkaisun toistokoodaavien DNA-sekvenssien tuottamiseen, joita voidaan manipuloida tarpeen mukaan.