Evaluation of an ultraviolet LED trap for catching Anopheles and Culex mosquitoes in south-eastern Tanzania

Kuvaus puolikenttäjärjestelmästä ja kenttäkokeiden tutkimusalueista

Kokeet suoritettiin sekä puolikenttä- että kenttäolosuhteissa. Kaikki puolikenttäkokeet tehtiin suuressa monikammioisessa suojahuoneessa (28,8 × 21 m) Ifakaran terveysinstituutissa, Ifakarassa, Tansaniassa. Käytimme 9,6 × 21 m:n kokoista osastoa, jossa oli kaksi koemökkiä, joiden ympärillä oli eri kasvillisuustyypeistä ja kivistä koostuva periferia-alue jäljitellaksemme paikallisia asumismuotoja ja ekologista asetelmaa.

Kenttäkokeet suoritettiin kylissä Ulangan piirikunnassa, Tansanian kaakkoisosassa, noin 20 km Ifakaran kaupungista etelään (kuva 1). Alue sijaitsee Kilomberon tulvatasangolla pohjoisessa sijaitsevien Udzungwa-vuorten ja etelässä sijaitsevien Mahenge-kukkuloiden välissä. Tärkeimmät elinkeinot ovat maatalous (lähinnä riisin ja maissin viljely), kalastus ja pienimuotoinen kauppa. Vuotuinen sademäärä on 1200-1800 millimetriä ja lämpötila 22-32,6 celsiusastetta. Lyhyitä sateita esiintyy marraskuusta joulukuuhun ja pitkiä sateita maaliskuusta kesäkuuhun.

Hyttyset

Käytetyt hyttyset olivat Anopheles arabiensis -lajin Ifakara-kannan pesäkkeitä, jotka perustettiin alun perin vuonna 2009 Lupiron kylästä, noin 25 kilometriä Ifakaran kaupungista etelään sijaitsevasta Lupiron kylästä saaduista yksilöistä. Pesäkkeitä pidetään 27 ± 2 °C:ssa ja 75 ± 10 prosentin suhteellisessa kosteudessa (RH) Batistan ym. aiemmin kuvaamalla tavalla. Toukat kasvatetaan muovialtaissa ja ruokitaan kahdesti päivässä Tetramin®-kalanruoalla (Tetra GmbH, Melle, Saksa). Aikuisia ruokitaan 10-prosenttisella glukoosiliuoksella. Pesäkkeiden ylläpitoon kuului myös ad libitum -veriateria, joka annettiin naaraille ihmisten vapaaehtoisten käsivarsien kautta. Kenttäkokeet kohdistuivat kuitenkin vapaasti lentäviin, eri lajeja edustaviin luonnonvaraisiin hyttysiin tutkimuskylistä.

Hyttysloukut ja vieheet

Tärkein koe-eläinehdokas oli Mosclean-loukku, joka emittoi 365 nm:n UV-säteilyä violeds™-tekniikan avulla ja tuottaa hiilidioksidikaasua fotokatalyyttisen reaktion kautta TiO2-levypinnoilla. Loukku on kooltaan 20 cm (halkaisija) ja 28,8 cm (korkeus), ja se toimii joko tasavirralla tai vaihtovirralla. Ne voivat toimia pienillä kannettavilla aurinkokennoilla, joilla voidaan ladata kannettavaa virtalähdettä käytettäväksi paikoissa, joissa ei ole sähköä.

Kuten kuvassa 2a näkyy, ansassa on viisi komponenttia: (i) kattolevy, jossa on ripustuslenkki ansan ripustamista varten ja varjostin UV-LEDien suorituskyvyn optimoimiseksi; (ii) pienitehoinen, hiljainen ja tehokas tuuletin hyttysten imua varten; (iii) UV-LED-levy, joka säteilee ultraviolettivaloa 365 nm:n aallonpituudella houkutellakseen hyttysiä puoleensa; (iv) säiliö loukkuun jääneiden hyttysten vangitsemiseksi; ja (v) fotokatalyytti, joka valmistajan mukaan vapauttaa hiilidioksidikaasua täydentääkseen hyttysten houkuttelua. Emme testanneet näiden ansojen CO2-tuotantoa kokeissamme, vaan arvioimme ansat juuri sellaisina kuin ne on saatu valmistajalta.

Mosclean-ansan pyyntitehokkuutta verrattiin muihin olemassa oleviin ansoihin, joita käytetään yleisesti sisä- ja ulkotilojen Anopheles- ja Culicine-hyttysten näytteenottoon. Ensimmäinen loukku oli CDC-light-loukku, jota käytetään laajalti sisätiloissa esiintyvien hyttysten pyydystämiseen. CDC-light-loukussa käytetään hehkulamppua pääasiallisena houkuttimena, ja se toimii paristolla toimivalla moottoroidulla tuulettimella. Toinen oli BG-Sentinel-loukku (Biogents GmbH, Regensburg, Saksa) . Loukku koostuu tummansinisestä kokoontaitettavasta ämpäristä, valkoisesta rei’itetystä kannesta, imusuppilosta, pyyntipussista ja paristolla toimivasta tuulettimesta . Sen halkaisija on 36 cm ja korkeus 40 cm. Viimeinen vertailuloukku oli Suna-loukku (Biogents GmbH), joka on halkaisijaltaan 52 cm ja korkeudeltaan 39 cm ja toimii myös akkuvirralla. Suna-loukku kuvattiin ja optimoitiin ensimmäisen kerran Länsi-Keniassa vuonna 2014, ja se osoitti suurta tehoa An. funestus -hyttysiä vastaan Rusingan saarella . Hiljattain sitä käytettiin Malawissa hyttysten näytteenottoon sisä- ja ulkotiloissa .

Sekä BG-Sentinel- että Suna-ansoja käytetään yleisesti hyttysten näytteenottoon ulkotiloissa, ja ne syötetään usein patentoidulla BG-vieheellä, hiilidioksidikaasulla tai muilla vieheillä . Tässä tutkimuksessa hiilidioksidia saatiin aina tarvittaessa hiiva-molassin käymisestä, ja sitä käytettiin eri vertailuloukuissa jäljempänä esitetyllä tavalla. Hiiva-melassiseos valmistettiin 30 minuuttia ennen kokeiden aloittamista sekoittamalla 40 g leipomohiivaa ja 500 ml melassia, jotka oli liuotettu 2 litraan vettä, ja poistokaasut johdettiin muoviletkujen kautta ansoihin. Aikuisten vapaaehtoisten miespuolisten vapaaehtoisten suorittamaa HLC:tä käytettiin myös standardivertailuna puolikenttäkokeissa, mutta ei kenttäkokeissa, koska luonnonvaraiset hyttyset saattavat olla tartuntavaarallisia.

Tutkimusmenetelmät

Puolikenttäkokeet Mosclean-ansan, CDC-valoansan, ihmisen laskeutumispyydysten (HLC), BG-Sentinel-ansan ja Suna-ansan pyyntitehokkuuden vertailemiseksi

Kokeet suoritettiin puolikenttäosastojen sisällä joka yö kello 18.00-06.00. Jokaisena yönä 400 laboratoriossa kasvatettua, 3-6 päivän ikäistä nulliparaattia An. arabiensis -naarasta, joita ei ollut aiemmin ruokittu veriruokinnalla, vapautettiin seulakammion sisälle. Koehyttysiä nälkiinnytettiin 6 tuntia ennen kutakin testiä, ja ne vapautettiin kammioon 30 minuuttia ennen testien aloittamista akklimatisoitumaan ympäristöön. Mökit puhdistettiin joka aamu (Prokopack-imurilla) ja ansoja seurattiin optimaalisen toimivuuden varmistamiseksi.

1. (i)

   Testit Mosclean-ansan ja CDC-light-ansan vertailemiseksi käyttäen syöttinä ihmisisäntää sänkyverkon alla

Ensin verrattiin Mosclean-ansan ja CDC-light-ansan välistä ansapyyntiä sisätiloissa testeissä, joissa molemmat ansat olivat samassa kammiossa samoina iltoina, niin että ansat kilpailivat samoista hyttysistä. Yksi Mosclean-loukku oli ripustettu yhden koemökin sisälle käsittelemättömän vuodeverkon viereen, jossa nukkui vapaaehtoinen aikuinen mieshenkilö (kuva 3b). Vastaavasti yksi CDC-light-loukku ripustettiin toisen mökin sisälle, myös vapaaehtoisen käytössä olleen vuodeverkon viereen (kuva 3a). Ansat olivat molemmat 150 cm maanpinnan yläpuolella ja lähellä vapaaehtoisten jalkoja. CDC-light-loukku ja Mosclean-loukku kierrätettiin majojen välillä öisin, jotta vältettäisiin sijaintivääristymät. Vapaaehtoiset säilyttivät kuitenkin paikkansa siten, että heidän yksilöllinen erilainen houkuttelevuutensa yhdistettiin kunkin majan ominaisuuksiin, jolloin muodostui yksi kokeellisen vaihtelun lähde. Jokaisena yönä 400 naaraspuolista An. arabiensis -hyttystä vapautettiin puolikenttäkammion keskiosasta, joka oli yhtä kaukana kahdesta majasta. Kussakin loukussa yön aikana kiinni jääneiden hyttysten kokonaismäärä kirjattiin ylös ja loukut puhdistettiin. Koe toistettiin 12 yön ajan, jolloin kukin loukku oli kummassakin majassa kuusi kertaa.

1. ii)

   Kokeet Mosclean-loukun ja HLC:n vertailemiseksi käyttäen syöttinä ihmisisäntää sängyn alle asetetun verkon alla

Toisessa kokeessa verrattiin Mosclean-loukkua ja HLC-loukkua keskenään niin ikään kilpailullisella menetelmällä. Yhdessä majassa Mosclean-loukku asetettiin vapaaehtoisen miehitetyn verkon viereen kuten edellä (kuva 3b), kun taas toisessa majassa HLC suoritettiin samana yönä aikuisen miespuolisen vapaaehtoisen toimesta. Vapaaehtoiset istuivat sisätiloissa ja taittelivat housujaan pyydystääkseen jalkoihinsa laskeutuvat hyttyset suuimureiden avulla. Näin molemmat pyyntimenetelmät kilpailivat samoista hyttysistä. Mosclean-loukku ja HLC-menetelmä vuorottelivat majojen välillä öisin, mutta vapaaehtoiset pysyivät samoissa majoissa. Joka yö 400 naaraspuolista An. arabiensis -hyttystä vapautettiin keskitetystä paikasta puolikenttäkammiossa, joka oli yhtä kaukana majoista. Hyttyssaaliit joko HLC- tai Mosclean-ansalla kirjattiin ja niitä verrattiin keskenään. Testi toistettiin 12 yön ajan, jolloin kumpikin menetelmä oli kussakin majassa kuusi kertaa.

1. (iii)

   Mosclean-ansan ja HLC:n ei-kilpailulliset testit, joissa käytettiin syöttinä ihmisisäntää sänkyverkon alla

Kolmannessa testissä Mosclean-ansa testattiin itsenäisesti HLC:tä vastaan erillisinä öinä, jotta vältettäisiin suora kilpailu ansojen välillä samoista hyttysistä. Loukku asetettiin ensimmäiseen (satunnaisesti valittuun) mökkiin ja siirrettiin sitten toiseen mökkiin toisena yönä. Kolmantena ja neljäntenä yönä HLC suoritettiin joko ensimmäisen tai toisen majan sisällä satunnaisessa järjestyksessä. Tämä järjestys satunnaistettiin siten, että testikierrokset alkoivat joko HLC:llä tai Mosclean-ansalla, ja se myös toistettiin kuusi kertaa. Jokaisena yönä 400 naaraspuolista An. arabiensis -hyttystä vapautettiin keskitetystä paikasta puolikenttäkammion sisällä. Kummallakin ansatyypillä kullakin yöllä ilman kilpailevaa vaihtoehtoa pyydystettyjen hyttysten lukumäärät kirjattiin verrattuina.

1. iv)

   Testit, joissa Mosclean-loukkua verrattiin suoraan yleisesti käytettyihin ulkotiloissa käytettäviin loukkuihin, esim. Suna- ja BG-Sentinel-ansoja

Toisin kuin kolmessa ensimmäisessä testissä, tässä kokeessa hyttysansojen pyynti suoritettiin ulkona, mutta puolikenttäkammioissa neljän yön jaksoissa käyttäen satunnaistettua 4 × 4 latinalaisen neliön mallia. Mosclean-ansasta käytettiin kahta erilaista vaihtoehtoa, joista ensimmäisessä ei ollut lisäsyöttiä ja toisessa oli lisäsyöttiä, johon oli lisätty hiiva-molassin käymisestä peräisin olevaa hiilidioksidia. Myös Suna-loukku (kuva 3d) ja BG-Sentinel (kuva 3c) syötettiin hiiva-massan käymisestä peräisin olevalla hiilidioksidilla. Neljä loukkutyyppiä, tavallinen Mosclean-loukku, CO2:lla syötetty Mosclean-loukku, CO2:lla syötetty Suna-loukku ja CO2:lla syötetty BG-Sentinel-loukku, kierrätettiin satunnaisesti neljänä yönä satunnaisesti neljässä ulkoilmapaikassa puolikenttäkammiossa neljän yön jaksoissa. Yhteensä 600 naaraspuolista An. arabiensis -lintua vapautettiin joka yö keskeiselle paikalle, joka oli yhtä kaukana kustakin ansapaikasta, ja saaliit kirjattiin ylös joka aamu. Koe toistettiin seitsemän kertaa 28 yön aikana, jolloin kukin ansatyyppi oli käynyt kussakin paikassa seitsemän kertaa.

Kenttäkokeet Mosclean-loukun, CDC-light-loukun, BG-Sentinel-loukun ja Suna-loukun pyyntitehokkuuden vertailemiseksi

Neljä erilaista kenttäkoetta tehtiin seuraavasti:

1. i)

   Mosclean- ja CDC-light-ansojen tehokkuuden vertailu näytteenotossa sisätiloissa isäntää etsivistä hyttysistä

Neljä taloa valittiin satunnaisesti kussakin tutkimuskylässä, ja ne rekrytoitiin sen jälkeen, kun kotitalouspäälliköiltä oli saatu suostumus. Jokaiseen taloon asetettiin joko Mosclean-loukku tai CDC-light-loukku sängyn viereen huoneeseen, jossa yksi aikuinen vapaaehtoinen nukkui verkon alla. Koska hyönteismyrkyllä käsiteltyjen verkkojen kattavuus oli > 90 prosenttia näissä kylissä, suoritimme tutkimuksemme näillä verkoilla eikä käsittelemättömillä verkoilla, joita käytettiin puolikenttäkokeissa. Pyydysten jakoaikataulun perusteella mökit 1, 2, 3 ja 4 saivat kumpikin jommankumman kahdesta pyydystyypistä. Pyydyksiin ei lisätty lisävieheitä. Loukut (1. Mosclean-loukku, 2. Mosclean-loukku, 1. CDC-light-loukku ja 2. CDC-light-loukku) vaihdettiin joka yö kunkin talon välillä 12 yön ajan 4 × 4 latinalaisen neliön mallin mukaisesti, joka toistettiin neljä kertaa. Testit kestivät klo 18:00-06:00 joka yö. Sekä Mosclean- että CDC-valoansat ripustettiin 150 cm maanpinnan yläpuolelle nukkuvien jalkojen kohdalle. Joka yö kuhunkin loukkuun tarttuneet hyttyset lajiteltiin taksonien, sukupuolen ja fysiologisen tilan mukaan, minkä jälkeen ne laskettiin ja kirjattiin.

1. ii)

   Mosclean-ansan suorituskyvyn vertailu, kun sitä käytetään sisällä ja ulkona

Tutkimuksissa, joissa mitataan malariavektorin aiheuttamaa puremisriskiä, on tavallista arvioida sisätiloissa tapahtuvan puremisen ja ulkona tapahtuvan puremisen osuuksia, jotta voidaan määrittää, missä puremisriski on suurempi, ja myös selvittää, kattavatko toimenpiteet, kuten ITN-verkot ja IRS, altistumisen koko spektrin. Valitettavasti viimeaikaisista innovaatioista, kuten sähköverkkopyydyksistä ja ihmisen syötillä varustetuista kaksoisverkkopyydyksistä, huolimatta ei ole olemassa muita sopivia pyyntijärjestelmiä kuin HLC-verkot, joilla nämä osuudet voitaisiin arvioida johdonmukaisesti ja tarkasti. Mosclean-loukku arvioitiin sen vuoksi sen määrittämiseksi, soveltuuko se keräyksiin sekä sisätiloissa että ulkona. Kustakin kylästä valittiin satunnaisesti neljä kotitaloutta, jotka rekrytoitiin kotitalouden johtajan suostumuksella. Sen jälkeen Mosclean-ansat asetettiin joko sisätiloihin tai ulkotiloihin kuhunkin taloon. Kun loukkua käytettiin sisätiloissa, se asetettiin käytössä olevan vuodeverkon viereen. Ulkona loukku asetettiin kuitenkin noin 5 metrin päähän talosta, mutta vapaaehtoisen aikuisen henkilön viereen, joka istui verkon alla. Ulkona Mosclean-loukku asetettiin 5 metrin päähän talosta, ja sen tarkoituksena oli pyydystää hyttyset, jotka lentävät lähellä ihmisasuntoja. Ansat olivat 150 cm maanpinnan yläpuolella sekä sisällä että ulkona. Joka aamu sisätiloista ja ulkotiloista pyydetyt hyttyset lajiteltiin taksonien, sukupuolen ja fysiologisen tilan mukaan, ja lukumäärät kirjattiin ja niitä verrattiin keskenään.

1. iii)

   Kokeet Mosclean-, BG-Sentinel- ja Suna-ansojen kenttätehokkuuden vertailemiseksi ulkona

Kokeet suoritettiin ulkona käyttäen 4 × 4 latinalaisen neliön suunnitelmaa, jossa ansojen paikat jaettiin satunnaisesti neljän näytteenottoyön kunkin kierroksen alussa. Mosclean-ansasta käytettiin kahta vaihtoehtoa, joista toista täydennettiin hiiva-massan käymisestä peräisin olevalla CO2-kaasulla ja toista ilman ylimääräistä CO2:ta. Kummassakin kylässä määritettiin neljä paikkaa, jotka sijaitsivat noin 100 metrin etäisyydellä toisistaan. Neljä ansatyyppiä, tavallinen Mosclean-loukku ilman lisäsyöttiä, CO2-syötteellä varustettu Mosclean-loukku, CO2-syötteellä varustettu Suna-loukku ja CO2-syötteellä varustettu BG-Sentinel-loukku, kierrätettiin öisin neljän ulkopaikan välillä neljän yön jaksoissa. Kullakin ansalla pyydetyt hyttyset lajiteltiin joka aamu taksonien, sukupuolen ja fysiologisen tilan mukaan, ja lukumäärät kirjattiin ja niitä verrattiin. Testit suoritettiin kuivana kautena kesäkuusta 2017 helmikuuhun 2018.

1. iv)

   Parous- ja hedelmöittyneiden naaraspuolisten Anopheles-hyttysten osuuksien arviointi Mosclean-loukkujen ja CDC-light-loukkujen saaliissa

Hyttysnäytteitä otettiin neljästä eri talosta yhdessä kylässä 20 yön ajan. Kaikki kerätyt naaraspuoliset An. arabiensis -hyttyset leikattiin. Samanlainen pyydystäminen tehtiin CDC-valoansoilla ja hyttyset leikattiin stereovalomikroskoopilla, jotta pariteetti- ja siemennystasoja voitiin verrata.

Desekoituja munasarjoja tai spermathecoja tarkasteltiin 10-kertaisella suurennoksella yhdistelmämikroskoopilla. Pariteettitilanne varmistettiin venytettyjen munasarjojen trakeolien (parous naaraat) tai kelautuneiden trakeolien (nulliparous naaraat) perusteella, kuten yksityiskohtaisesti on esitetty. Siemennykset vahvistettiin havainnoimalla, olivatko spermathekat täynnä vai täyttymättömiä.

Tietojen analysointi

Tiedot analysoitiin käyttäen avoimen lähdekoodin tilasto-ohjelmistoa, R v.3.5.0 . Mosclean-ansan tehokkuutta verrattiin muiden ansojen tehokkuuteen sovittamalla yleistettyjä lineaarisia sekamuotoja (GLMM) käyttäen pakettia lme4 . Eri lajien hyttysten määrä mallinnettiin negatiivisten binomijakaumien mukaisesti, ja ansan tyyppi oli päävaikutus. Koepäivät ja majan tunnus otettiin mukaan satunnaisterminä selittämättömän vaihtelun huomioon ottamiseksi päivien ja majojen sisällä. Kuvaajat luotiin ggplot2-paketilla. Logistista regressiota käytettiin CDC-light-loukun ja Mosclean-loukun pariteetti- ja siemennystasojen arvioimiseksi. Satunnaisvaikutuksen vaikutuksen tarkistamiseksi käytettiin likelihood ratio -testiä.