Extrinsic versus intrinsic apoptoosireitit syövän vastaisessa kemoterapiassa

Signaalinanto apoptoosin intrinsic-reitin kautta

Apoptoosin mitokondriaalisen reitin kautta, kaspaasiaktivaatio liittyy läheisesti siihen, että Bcl-perheen proapoptoottiset jäsenet permeabilisoivat ulomman mitokondriokalvon (Green ja Kroemer, 2004). Lukuisat sytotoksiset ärsykkeet ja proapoptoottisia signaaleja välittävät molekyylit lähestyvät mitokondrioita indusoidakseen ulomman mitokondriokalvon permeabilisaation (Decaudin ym., 1998; Green ja Kroemer, 2004). Tätä permeabilisaatiota säätelevät Bcl-2-perheeseen kuuluvat proteiinit, mitokondrioiden lipidit, bioenergisiä metaboliittivirtoja säätelevät proteiinit ja läpäisevyyden siirtymähuokosen komponentit (Green ja Kroemer, 2004). Ulomman mitokondriokalvon rikkoutuessa vapautuu joukko proteiineja, joita normaalisti on sisemmän ja ulomman mitokondriokalvon välissä, mukaan lukien sytokromi c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF ja endonukleaasi G (Saelens ym., 2004). Sytosoliin päästyään nämä apoptogeeniset proteiinit käynnistävät solukuoleman edistämällä kaspaasiaktivaatiota tai toimimalla kaspaasista riippumattomina kuolemanvaikuttajina (Saelens et al., 2004).

Kaspaasiriippuvaisen apoptoosin mitokondriaaliset välittäjät

Sytokromi c

Sytokromi c:n vapautuminen mitokondrioista laukaisee suoraan kaspaasi-3:n aktivaation muodostamalla sytokromi c:n/Apaf-1:n/ kaspaasi-9:n sisältävän apoptosomikompleksin (Cain ym., 2000). Sytosoliin päästyään sytokromi c sitoutuu Apaf-1:n C-terminaaliseen alueeseen. Apaf-1 on sytosoliproteiini, jolla on N-terminaalinen kaspaasin rekrytointidomeeni (CARD), nukleotideja sitova domeeni, joka on homologinen Caenorhabditis elegansin CED-4:n kanssa, ja C-terminaalinen domeeni, joka sisältää 12-13 WD-40-toistoa (Zou ym., 1997). Sytokromi c:n sitoutuminen Apaf-1:een helpottaa dATP:n assosioitumista Apaf-1:n kanssa ja paljastaa sen N-terminaalisen CARD:n, joka voi nyt oligomerisoitua ja tulla alustaksi, jolle initiaattorina toimiva kaspaasi-9 rekrytoituu ja aktivoituu CARD-CARD-vuorovaikutuksen kautta (Adrain et al., 1999). Tämän jälkeen eksekutiivinen kaspaasi-3 rekrytoituu apoptosomiin, jossa residenssissä oleva kaspaasi-9 aktivoi sen (Bratton ym., 2001). Tämän jälkeen kaspaasi-3 pilkkoo solun keskeisiä substraatteja tuottaen monia apoptoosin solu- ja biokemiallisia tapahtumia.

Tietyissä tapauksissa sytosolisen sytokromi c:n käynnistämä kaspaasiaktiivisuus vaikuttaa osaltaan matriksin metalloproteinaasin (MMP) putoamiseen, kuten osoitettiin synteettisten kaspaasi-inhibiittoreiden ja Apaf1 -/–solujen avulla (Waterhouse ym., 2001). Lisäksi kaspaasiaktiivisuus vahingoittaa permeabiloitujen mitokondrioiden toimintaa entisestään vaikuttamalla kompleksien I ja II aktiivisuuteen, mikä johtaa väistämättä MMP:n häviämiseen ja reaktiivisten happilajien syntymiseen (Ricci ym., 2004). Siten sytokromi c:n ja muiden mitokondrioiden IMS-proteiinien vapautumisen aiheuttamista sytosolisista muutoksista johtuvat sekundaariset tapahtumat voivat palautua permeabiloituihin mitokondrioihin ja vaikuttaa niiden toimintaan. Tärkeää on, että tämä kaspaasiaktiivisuuden mitokondriaalinen vahvistussilmukka saattaa ratkaisevasti määrittää syöpäsolujen vasteen sytotoksisille hoidoille.

Lisäksi viime aikoina on saatu näyttöä sytokromi c:stä ja apoptosomista riippumattoman, mutta Apaf-1:stä riippuvaisen mekanismin (mekanismien) olemassaolosta kaspaasiaktivaatiossa. Sytokromi c:n sellaisen muunnoksen kohdennettu knock-in, jolla ei ole apoptogeenisia ominaisuuksia mutta jolla on elektroninsiirto- ja antioksidanttitoimintaa (K72A), mahdollisti sytokromi c:n osuuden arvioinnin apoptoosissa vaikuttamatta sen tehtävään oksidatiivisessa fosforylaatiossa (Hao ym., 2005). Mielenkiintoista oli, että KA/KA-hiirten kymosyytit olivat selvästi herkempiä kuolemaan johtaville ärsykkeille, kuten etoposidille ja γ-säteilytykselle, kuin Apaf-1(-/-) -kymosyytit (Hao ym., 2005). Käsiteltäessä γ-säteilytyksellä prokaspasit aktivoituivat tehokkaasti apoptoottisissa KA/KA-tymosyyteissä, mutta Apaf-1:n oligomerisaatiota ei havaittu (Hao et al., 2005), mikä viittaa sytokromi c:n ja Apaf-1:n erilaiseen vaatimukseen apoptoosissa.

Smac/DIABLO

Muut mitokondrioista vapautuvat proteiinit, kuten Smac/DIABLO ja Omi/HtrA2, helpottavat kaspaasiaktivaatiota neutralisoimalla kaspaasien endogeenisia inhibiittoreita, apoptoosin inhibiittoriproteiineja (Inhibitor of Apoptosis Proteins, IAPs). Smac ja sen hiirihomologi DIABLO ovat ydinkoodattuja mitokondrioproteiineja, jotka sisältävät mitokondriaalisen lokalisointisignaalin, joka poistetaan proteolyyttisesti mitokondriotuonnin yhteydessä, jolloin saadaan kypsä 23 kDa:n proteiini (Du ym., 2000; Verhagen ym., 2000). Tämä kypsymisvaihe paljastaa Smac/DIABLO:n N-terminaalissa olevan IAP-sidontamotiivin (IBM) (Du et al., 2000) (taulukko 1). Toisen mitokondrioista peräisin olevan kaspaasiaktivaattorin/DIABLO:n osoitettiin sitoutuvan XIAP:hen, cIAP1:een, cIAP2:een, surviviniin ja Apolloniin BIR-riippuvaisella tavalla (Vaux ja Silke, 2003) (kuva 2),ja se toimii homodimeerinä, jossa IBM on läsnä kaksiarvoisessa konfiguraatiossa (Chai et al., 2000). Yksi Smac/DIABLO-dimeeri sitoo yhtä XIAP-molekyyliä molempien IAP:tä sitovien motiivien avulla, joista toinen on vuorovaikutuksessa BIR2:n ja toinen BIR3:n kanssa (Huang ym., 2003). Mielenkiintoista on, että sama BIR3-ura sitoo kaspaasi-9:n pienen alayksikön N-terminaalissa (Ala-Thr-Pro-Phe) paljastunutta IBM:ää sen autokatalyyttisen prosessoinnin jälkeen Asp315:n jälkeen, jolloin Smac/DIABLO voi syrjäyttää kaspaasi-9:n XIAP:stä (Srinivasula et al., 2001) (Taulukko 1).

Smac/DIABLO:n fysiologista mitokondriofunktiota ei tunneta, ja DIABLO -/- hiiret vaikuttavat normaaleilta (Okada ym., 2002). Vaikka prokaspaasi-3:n pilkkoutuminen in vitro sytokromi c:tä lisättäessä estyi Smac -/- -solujen lysaateissa, Smac -/- -hiiret ja solut reagoivat normaalisti apoptoottisiin ärsykkeisiin, kuten UV-säteilyyn, staurosporiiniin, etoposidiin ja TNF/sykloheksamidiin (Okada ym., 2002). Nämä havainnot viittaavat siihen, että on olemassa redundantteja tekijöitä, jotka kompensoivat Smac/DIABLO:n menetyksen, mahdollisesti HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 on ydinkoodattu 49 kDa:n proteiini, jolla on N-terminaalinen mitokondriaalinen lokalisointisignaali, joka välittää sen translokaation mitokondrioiden väliseen kalvotilaan (Suzuki ym., 2001; Martins ym., 2002; van Loo ym., 2002). Omi/HtrA2 prosessoituu intermembraanitilassa 37 kDa:n kypsäksi muodoksi, jolloin sen N-terminaalista vapautuu IBM (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (taulukko 1). Vaikka rekombinantti Omi/HtrA2 voi katalysoida omaa kypsymistään in vitro, proteaasi, joka vastaa sen kypsymisestä soluissa, on edelleen tuntematon (Martins ym., 2002). Omi/HtrA2:lla on olennainen rooli mitokondrioiden homeostaasin säätelyssä, mikä edellyttää sen proteolyyttistä aktiivisuutta, vaikka Omi/HtrA2:n molekulaarisia kohteita ja vuorovaikutuskumppaneita mitokondriossa ei ole vielä määritelty (Saelens ym., 2004). Kun Omi/HtrA2 vapautuu mitokondrioista sytosoliin, se edistää solukuolemaa kaspaasi-riippuvaisella tavalla antagonisoimalla IAP:tä ja kaspaasista riippumattomalla tavalla proteaasina (Saelens ym., 2004). Samoin kuin Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 estää IAP:itä N-terminaalisen IAP:itä sitovan motiivinsa kautta, joka esiintyy trimeerisessä konfiguraatiossa (Li et al., 2002)

Vaikka sytokromi c:n vapautuminen sytosoliin käynnistää suoraan kaspaasi-3:n aktivaation muodostamalla sytokromi c:n/Apaf-1:n/ kaspaasi-9:n sisältävän apoptosomikompleksin, Smac/DIABLO ja Omi/HtrA2 edistävät epäsuorasti kaspaasiaktivaatiota antagonisoimalla IAP:ien estovaikutukset (Saelens ym., 2004). Näin ollen pro- ja antiapoptoottisten efektorimolekyylien välillä vallitsee dynaaminen tasapaino, jonka ansiosta solu voi selviytyä rajoitetusta mitokondriovauriosta, jolloin IAP:t voivat riittävällä tavalla estää pienen vapautuneen sytokromi c:n määrän käynnistämän kaspaasiaktivaation. Olosuhteissa, joissa mitokondriovaurio etenee tai vaikuttaa samanaikaisesti useisiin mitokondrioihin, IAP:iden asettama antiapoptoottinen este voidaan kuitenkin ylittää niiden antagonistien Smac/DIABLO ja HtrA2/OMI korkeammalla sytosolikonsentraatiolla, jotka neutralisoivat IAP:itä suoraan sitoutumalla.

On yhä enemmän näyttöä siitä, että syöpäsoluilla on sisäinen apoptoosiajattelu, jota IAP:t hillitsevät. Tätä varten eri kasvainsolulinjoissa ja syöpäkudoksissa, mutta ei normaaleissa soluissa, havaittiin korkeita kaspaasi-3- ja kaspaasi-8-aktiivisuuden perustasoja ja aktiivisia kaspaasi-3-fragmentteja ilman apoptoosia (Yang ym., 2003a). Kasvainsolut, mutta eivät normaalit solut, ekspressoivat myös suuria määriä IAP:tä, mikä viittaa siihen, että säännelty IAP:n ekspressio tasoitti korkeaa basaalista kaspaasiaktiivisuutta valikoivasti kasvainsoluissa (Yang ym., 2003a). Tämän vuoksi IAP:iin kohdistuvia strategioita pidetään lupaavana lähestymistapana sytotoksisten hoitojen tehon parantamiseksi valikoivasti syöpäsoluissa. Tätä varten Smac/DIABLO:n transfektiovahvistettu ilmentyminen alensi TRAIL:n aiheuttaman tappamisen kynnystä erilaisissa kasvaimissa (Ng ja Bonavida, 2002; Okano ym., 2003) ja myös herkisti syöpäsoluja kemoterapialle (McNeish ym., 2003; Zhao ym., 2006). Endogeenisen Smac/DIABLO:n translokaatiolla sytosoliin syöpälääkkeiden aiheuttaman apoptoosin aikana ei kuitenkaan näytä olevan suurta merkitystä tietyissä olosuhteissa, esimerkiksi ihmisen keuhkokarsinoomasoluissa etoposidikäsittelyn yhteydessä (Bartling ym., 2004). Smac/DIABLO:n alaregulaatio pienellä häiritsevällä RNA:lla (siRNA) ei vaikuttanut etoposidin aiheuttamaan tappamiseen näissä soluissa, vaikka IAP:tä sitova peptidi Smac-N7 lisäsi etoposidin aiheuttamaa apoptoosia (Bartling ym., 2004). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Smac/DIABLO-puutos voidaan kompensoida redundanttien determinanttien vaikutuksella tietyissä syöpäsoluissa.

Kaspaasista riippumattoman apoptoosin mitokondriaaliset välittäjät

Vapautuessaan mitokondrioiden välikalvotilasta HtrA2/OMI edistää solukuolemaa myös kaspaasista riippumattomalla tavalla proteaasina sen lisäksi, että se edistää apoptoosia kaspaasista riippuvalla tavalla antagonisoimalla IAP:itä (Suzuki et al., 2001; Martins ym., 2002; van Loo ym., 2002). In vitro -tiedot osoittivat XIAP:n, cIAP1:n, cIAP2:n ja Apollonin hajoamisen HtrA2/OMI:n proteaasiaktiivisuuden avulla (Suzuki ym., 2004). Lisäksi Trencia et al. (2004) osoittivat antiapoptoottisen PED/PEA-15:n vuorovaikutuksen sytosolisen HtrA2/OMI:n kanssa ja sen hajoamisen. HtrA2/OMI:n määrän vähentäminen soluissa antisense- tai RNA-interferenssillä alentaa eri syöpäsolulinjojen herkkyyttä staurosporinin, Fasin, UV:n tai sisplatiinin aiheuttamalle solukuolemalle (Martins ym, 2002).

Lisäksi AIF ja endonukleaasi G vapautuvat mitokondrioista ulkoisen mitokondriokalvon permeabiloituessa ja translokoituvat ytimeen edistääkseen ydinkromatiinin tiivistymistä ja laajamittaista DNA:n pirstoutumista (Cande ym., 2004; Saelens ym., 2004). Siitä, vapautuvatko nämä kaksi proteiinia ennen sytokromi c:tä, yhdessä vai sen jälkeen, on keskusteltu kiistanalaisesti (Arnoult ym., 2002). Ei ole myöskään vielä täysin selvää, miten AIF vaikuttaa ydin-DNA:n pirstoutumiseen, koska sillä ei ole luontaista DNaasiaktiivisuutta. Nisäkässoluissa syklofiliini A, joka on peptidyyli-prolyyli cis-trans-isomeraasi, toimii yhteistyössä AIF:n kanssa DNA:n hajoamisen indusoimiseksi (Cande ym., 2004).

Sisäisen reitin häiriö syövässä

Mutaatiot mitokondriaalisen reitin säätelyyn osallistuvissa geeneissä ovat hyvin yleisiä syöpäsoluissa. Koska suurin osa syöpähoidoista saa aikaan apoptoosin syöpäsoluissa käynnistämällä intrinsic-reitin, tällaiset mutaatiot liittyvät yleensä hoitoresistenssiin. Esimerkiksi Bcl-2:n yliekspressio, joka on seurausta bcl-2-onkogeenin kromosomaalisesta translokaatiosta immunglobuliinin raskaan ketjun geenipaikalle, liittyy noin 85 prosenttiin ihmisen follikulaarisista lymfoomista (Tsujimoto ym., 1984). Kokeet siirtogeenisillä hiirillä ovat osoittaneet, että Bcl-2:n yliekspressio voi edistää B- ja T-lymfosyyttien ja myelooisten solujen neoplastista transformaatiota (McDonnell ja Korsmeyer, 1991; Traver ym., 1998).

Kun otetaan huomioon, että antiapoptoottisten Bcl-2:n perheen jäsenten yliekspressio edistää onkogeneesiä, siitä seuraa, että tämän perheen moni-BH-domeenin omaavat proapoptoottiset jäsenet toimivat tuumorisuppressoreina. Koska Baxilla ja Bakilla on kuitenkin pitkälti päällekkäiset tehtävät apoptoosissa, on ollut vaikea määrittää, pitääkö tämä hypoteesi paikkansa, ja bax-/-hiiret eivät olekaan selvästi alttiita neoplasialle (Knudson ym., 2001). Somaattisia mutaatioita, jotka inaktivoivat bax-geenin, on kuitenkin löydetty tietyissä kiinteissä kasvaimissa ja hematologisissa pahanlaatuisissa kasvaimissa. Tätä varten on kuvattu yhden nukleotidin substituutio- tai frameshift-mutaatioita, jotka inaktivoivat bax-geenin mismatch repair-deficient (MMR) paksusuolen syövässä tai hematopoieettisissa pahanlaatuisissa kasvaimissa (Rampino ym., 1997; Kitada ym., 2002).

Lisäksi on yhä enemmän näyttöä siitä, että BH3-only-proteiinit voivat osaltaan tukahduttaa pahanlaatuisen transformaation kehittymistä, mikä viittaa siihen, että ne voivat toimia hyvässä uskossa kasvainsuppressoreina. Esimerkiksi yhden Bim-alleelin menettämisen osoitettiin kiihdyttävän c-myc-transgeenin ilmentämisen indusoimaa B-solujen lymfomageneesiä (Egle ym., 2004), mikä vastaa Bimin keskeistä roolia lymfaattisen homeostaasin säätelijänä (Strasser, 2005). Mielenkiintoista on, että homotsygoottisia deleetioita kromosomialueella, jossa bim-geeni sijaitsee, on hiljattain havaittu potilailla, joilla on manttelisolulymfooma (Tagawa ym., 2005). Hiiret, joilta puuttuu bid-geeni, saavat spontaanisti myeloproliferatiivisen sairauden, joka voi kehittyä kroonista myelomonosyyttistä leukemiaa (CMML) muistuttavaksi pahanlaatuiseksi sairaudeksi (Zinkel ym., 2003). Lisäksi Puman RNAi-välitteisen suppression raportoitiin kiihdyttävän Myc:n indusoimaa lymfomageneesiä (Hemann ym., 2004).

Geettisten muutosten lisäksi Bcl-2-perheen proteiinien poikkeavaa ilmentymistä säädellään useimmiten transkriptionaalisella tai post-transkriptionaalisella tasolla. Esimerkiksi useiden antiapoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinien, esimerkiksi Bcl-2:n, Bcl-XL:n, Mcl-1:n tai Bfl-1:n, ilmentymistä säätelee transkriptiivisesti NF-κB (Cory ja Adams, 2002).

Bcl-2-perheen proteiinien lisäksi munasarjasyövässä, melanoomassa ja leukemiassa on havaittu vähentynyttä tai puuttuvaa Apaf-1:n toimintaa. Lisäksi mutaatiot kasvainsuppressorigeenissä p53, joka on yleisin geenivirhe ihmisen syövissä, vaikuttavat sisäiseen reittiin. Esimerkiksi p53:n aktivaatio säätelee useita geenejä, joiden promoottoreissa on p53-responsiivisia elementtejä, kuten proapoptoottisia BH3-proteiineja Puma, Noxa ja Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Tämän seurauksena solut, joissa p53 on stabiloitunut, ovat herkkiä mitokondriaalisen solukuolemareitin aktivoitumiselle. Lisäksi p53 voi vaikuttaa suoraan mitokondrioiden eheyteen ilman geenien aktivointia. Onkin raportoitu, että p53 voi sitoutua Bcl-2:een ja Bcl-XL:ään mitokondrioissa ja siten edistää mitokondrioiden destabilisaatiota (Mihara et al., 2003).

Signaalinvälitys sisäisen reitin kautta syövän hoidossa

Useimmat tavanomaiset kemoterapeuttiset aineet, esimerkiksi etoposidi, doksorubisiini, sisplatiini tai paklitakseli, saavat aikaan mitokondrioiden permeabilisaation epäsuoralla tavalla laukaisemalla intermediaarisen aineenvaihdunnan häiriöitä tai lisäämällä proapoptoottisten kakkoslähettiläiden pitoisuuksia, esimerkiksi indusoimalla p53-ekspressiota, indusoimalla keramidi/GD3-reittiä, indusoimalla CD95/CD95L-ligandijärjestelmää, vaikuttamalla Bcl-2:n kaltaisiin proteiineihin ja/tai heikentämällä redox- tai energiatasapainoa.

On yhä enemmän näyttöä siitä, että DNA-vaurion jälkeen on olemassa nukleo-mitokondriaalinen ristikkäisviestintä. Esimerkiksi DNA-vaurion aiheuttamat apoptoottiset signaalit voivat välittyä kasvainsuppressori p53:n välityksellä mitokondrioihin, jotka puolestaan vapauttavat sytoplasmaan apoptogeenisia tekijöitä, jotka aktivoivat myötävirran tuhoutumisohjelmia (Moll ym., 2005). p53 voi epäsuorasti kytkeytyä mitokondriaaliseen reittiin aktivoimalla transkriptiivisesti proapoptoottisten Bcl-2-proteiinien, esimerkiksi Bid:n, Puma:n tai Noxa:n, ilmentymää (Oda ym., 2000; Yu ym., 2001; Sax ym., 2002). Lisäksi p53 voi laukaista suoraan mitokondrioiden ulomman kalvon permeabilisaation transkriptiosta riippumattomalla tavalla aktivoimalla suoraan proapoptoottisia Bcl-2- proteiineja Bax tai Bak tai sitomalla ja inaktivoimalla antiapoptoottisia Bcl-2- proteiineja, kuten Bcl-2:ta tai Bcl-XL:ää (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Tärkeää on, että mitokondrioon kohdistuvalla p53:lla on äskettäin osoitettu olevan kasvainsuppressoriaktiivisuutta myös in vivo (Talos ym., 2005).

Lisäksi kaspaasi-2:lla on kyky käynnistää mitokondriaalinen apoptoosireitti vastauksena DNA-vaurioon permeabilisoimalla mitokondrioiden ulkopuolista kalvoa ja/tai katkaisemalla sytokromi c:n assosiaatio mitokondrioiden sisäiseen kalvoon. Näin ollen solut, jotka olivat stabiilisti transfektoituja prokaspaasi-2:n antisense-entsyymillä tai transientisti siRNA:ta ilmentävillä soluilla, olivat vastustuskykyisiä sytokromi c:n vapautumiselle ja erilaisille DNA-vaurion aiheuttamille myöhemmille tapahtumille, kuten kaspaasiaktivaatiolle ja DNA:n pirstoutumiselle (Lassus ym., 2002; Robertson ym., 2002). Kaspaasi-2 voi vaikuttaa epäsuorasti mitokondrioihin esimerkiksi pilkkomalla proapoptoottista proteiinia Bid, minkä jälkeen se siirtyy mitokondrioihin indusoimaan sytokromi c:n vapautumista (Guo ym., 2002). Lisäksi kaspaasi-2 voi suoraan permeabiloida ulomman mitokondriokalvon ja stimuloida sytokromi c:n ja Smac/DIABLO:n vapautumista, mahdollisesti prosessoidun kaspaasi-2:n suoran vuorovaikutuksen seurauksena oletettujen proteiinien ja/tai fosfolipidien kanssa, jotka sijaitsevat ulommassa mitokondriokalvossa tai ulomman ja sisemmän kalvon välisissä kosketuskohdissa (Robertson et al., 2004). Ulomman mitokondriokalvon permeabilointi edellyttää kaspaasi-2:n zymogeenin prosessointia, mutta ei siihen liittyvää proteolyyttistä aktiivisuutta, ja se tapahtuu useista Bcl-2-perheen proteiineista, kuten Baxista, Bakista ja Bcl-2:sta, riippumatta (Robertson ym., 2004). Lisäksi todettiin, että kaspaasi-2:lla on myös yllättävä kyky häiritä sytokromi c:n ja anionisten fosfolipidien, erityisesti kardiolipiinin, välistä assosiaatiota, jolloin ylimääräistä sytokromi c:tä vapautuu sytosoliin (Enoksson et al., 2004). DNA-vaurion yhteydessä kaspaasi-2:n on äskettäin raportoitu aktivoituvan niin sanotussa PIDDosomissa, joka on p53:n indusoiman, kuoleman domeenin sisältävän PIDD-proteiinin, kaspaasi-2:n ja adaptoriproteiinin RAIDD:n muodostama kompleksi (Tinel ja Tschopp, 2004), mikä viittaa nukleo-mitokondriaalisen apoptoosireitin olemassaoloon.

Lisäksi histoni H1.2:lla on raportoitu olevan tärkeä rooli apoptoottisten signaalien välittämisessä ytimestä mitokondrioihin DNA:n kaksoissidekatkosten jälkeen (Konishi et al., 2003). Ydinhistoni H1.2 vapautuu sytoplasmaan p53-riippuvaisella mekanismilla DNA:n kaksoissäikeiden katkeamisten jälkeen ja indusoi sytokromi c:n vapautumista eristetyistä mitokondrioista Bak-riippuvaisella tavalla (Konishi ym., 2003). H1.2:n ilmentymisen vähentäminen lisäsi solujen vastustuskykyä röntgensäteilyn tai etoposidin indusoimaa apoptoosia vastaan (Konishi ym., 2003).

Lisäksi orpo ydinreseptori Nur77 (tunnetaan myös nimellä TR3) on hiljattain kytketty Bcl-2:n apoptoottiseen koneistoon mitokondrioissa (Lin ym., 2004). Nur77:n sitoutuminen Bcl-2:n N-terminaaliseen silmukka-alueeseen, joka sijaitsee sen BH4- ja BH3-domeenien välissä, saa aikaan Bcl-2:n konformaatiomuutoksen, joka paljastaa sen BH3-domeenin, mikä johtaa Bcl-2:n muuttumiseen suojelijasta tappajaksi (Lin et al., 2004). Mielenkiintoista on, että Nur77-perheen jäsenen kohonneet tasot on yhdistetty suotuisaan vasteeseen kemoterapeuttisille aineille potilailla (Shipp ym., 2002).

Lisäksi solustressin, mukaan lukien kemoterapeuttiset lääkkeet, vaikutuksesta spesifiset proapoptoottiset Bcl-2:n perheen jäsenet aktivoituvat, purkautuvat tai indusoituvat ja toimivat siten sensoreina. Pelkkien BH3-proteiinien aktiivisuutta pidetään kurissa useilla mekanismeilla, jotka pitävät nämä proteiinit poissa moniosaisten Bcl-2:n vastaavien proteiinien ulottuvilta normaalioloissa, mutta mahdollistavat niiden nopean aktivoitumisen stressitilanteissa (Bouillet ja Strasser, 2002). Kuten edellä mainittiin, Bcl-2-perheen proteiinit, kuten Bid, Puma tai Noxa, ovat kasvainsuppressori p53:n transkriptionaalisen kontrollin alaisina, ja näin ollen ne säätyvät ylöspäin vastauksena DNA:ta vahingoittaviin tekijöihin (Oda ym., 2000; Yu ym., 2001; Sax ym., 2002). Vain BH3:a sisältävä proteiini Bim, joka liittyy sytoskelettiin sitoutumalla mikrotubuluksiin, vapautuu ja aktivoi intrinsisen reitin käsittelyn jälkeen, kun sitä on käsitelty mikrotubulusten kokoonpanoon vaikuttavalla taksolilla (Sunters et al., 2003). Viime aikoina on osoitettu, että paklitakseli indusoi Bimin kertymistä ja Bim-riippuvaista apoptoosia epiteelikasvaimissa in vitro ja myös in vivo (Tan ym., 2005). Aktiiviset BH3-only-proteiinit sitovat ja torjuvat antiapoptoottisia ja joissakin tapauksissa aktivoivat monialueisia proapoptoottisia Bcl-2-perheen jäseniä, mikä johtaa mitokondriokalvojen läpäisevyyden menetykseen (Bouillet ja Strasser, 2002). Se, miten Bcl-2-proteiinit aiheuttavat mitokondrioiden ulkokalvon häiriöitä, on edelleen kiistanalainen kysymys, ja siihen voi liittyä joidenkin Bcl-2-tuoteperheen proteiinien huokostenmuodostus- ja itseoligomeroitumiskyky, mitokondrioiden permeabiliteettitransitiohuokosten modulaatio Bcl-2-tuoteperheen proteiinien toimesta ja/tai lipidimuutokset ja lipidiproteiinien vuorovaikutussuhteet mitokondrioiden kalvojen sisällä. Lisäksi kemoterapeuttiset aineet, kuten paklitakseli, aiheuttavat Bcl-2:n hyperfosforylaatiota ja inaktivoitumista ja edistävät samalla permeabiliteettitransition (PT) -huokosen avautumista (Ruvolo et al., 2001).

Kemoterapeuttiset lääkkeet voivat myös indusoida tai edesauttaa ulomman mitokondriokalvon permeabiloitumista solun redox-potentiaalin muutosten kautta, jotka johtuvat lisääntyneestä reaktiivisten happilajien synnystä (tai niiden detoksifikaation vähenemisestä), pelkistyneen glutationin köyhtymisestä tai NADPH:n köyhtymisestä, sillä mitokondrioiden megakanavalla on useita redox-herkkiä kohtia (Debatin ym., 2002). Lisäksi muutokset energia-aineenvaihdunnassa, esimerkiksi ADP:n ja ATP:n väheneminen, saattavat helpottaa permeabiliteettitransformaatiokompleksin (permeability transition pore complex, PTPC) avautumista, koska ADP ja ATP ovat adeniininukleotiditranslokaattorin fysiologisia ligandeja, jotka toimivat PTPC:n endogeenisina inhibiittoreina (Costantini ym., 2000). Myös hengitysketjun irrottaminen tai estäminen tai matriisin alkalisoituminen voivat suosia mitokondriokalvon permeabilisaatiota. Lisäksi lipidilähettiläät, kuten keramidi, jota syntyy soluissa, jotka altistuvat useille apoptoosia aiheuttaville ärsykkeille, kuten sytotoksisille lääkkeille, voivat edistää mitokondriokalvojen permeabilisaatiota (Susin ym., 1997). Suurina pitoisuuksina. jotkin kemoterapeuttiset lääkkeet, esimerkiksi etoposidi tai paklitakseli, voivat myös indusoida mitokondrioiden ulkokalvojen permeabilisaatiota eristetyissä mitokondrioissa (Robertson ym., 2000; Kidd ym., 2000), 2002).

Lisäksi yhä useampien kokeellisten syöpälääkkeiden, kuten arseniitin, lonidamidin, synteettisen retinoidin CD437 tai luonnontuotteen betuliinihapon, on osoitettu vaikuttavan suoraan mitokondrioihin (Debatin ym., 2002). Esimerkiksi betuliinihapon on raportoitu laukaisevan apoptoosin indusoimalla suoraan mitokondrioiden kalvopotentiaalin menetyksen eristetyissä mitokondrioissa tavalla, johon kaspaasi-inhibiittori Z-VAD-fmk ei vaikuta ja joka kuitenkin estyy BA:lla, PTPC:n inhibiittorilla, tai Bcl-2:lla ja Bcl-XL:llä (Fulda ym., ), 1998b).

STRATEGIAT, JOTKA KOHDISTUVAT ITSENÄISEEN REITTIIN

Bcl-2-perheen proteiinit

Koska antiapoptoottisia Bcl-2- proteiineja, jotka estävät tehokkaasti ITSENÄISEN apoptoosireitin, esiintyy kohonneina pitoisuuksina ihmisen syöpätaudeissa, jotka ovat alkuperältään sekä hematologisia että muita kuin hematologisia syövän aiheuttajia (Cotter, 2004), ne edustavat lupaavia kohteita, joihin on mahdollista kohdistaa terapeuttisia hoitotoimenpiteitä. Tämän vuoksi on kehitetty useita strategioita Bcl-2-proteiineihin kohdistamiseksi, esimerkiksi antisense-tekniikoita, BH3-domeenipeptidejä tai synteettisiä pienimolekyylisiä lääkkeitä, jotka häiritsevät Bcl-2:n kaltaisten proteiinien toimintaa. Bcl-2:n ilmentymisen alentamiseksi Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, Yhdysvallat) kehitti Bcl-2:n antisense-oligonukleotidexin (genasense). Genasense on synteettinen, 18-emäksinen, yksisäikeinen fosforitioaattioligonukleotidi, joka kohdistuu selektiivisesti Bcl-2-proteiinia koodaavan mRNA:n avoimen lukukehyksen kuuteen ensimmäiseen koodoniin (eli 18 emäkseen) (Cotter, 2004). Genasense-hoito lisäsi huomattavasti monien kemoterapeuttisten lääkkeiden, esimerkiksi taksaanien, antrasykliinien, alkylaattorien tai platinaa sisältävien aineiden kasvainvastaista vaikutusta (Cotter, 2004). Prekliinisessä melanoomamallissa genasense-esikäsittely lisäsi ihmisen melanooman kemosensitiivisyyttä (Jansen ym., 1998). Myös kliinisessä tutkimuksessa genasensen raportoitiin toimivan dakarbatsiinin kemosensitiivistäjänä pahanlaatuista melanoomaa sairastavilla potilailla (Jansen ym., 2000). Antisense-pohjaisen hoidon optimoimiseksi suunniteltiin sittemmin bispesifisiä antisense-oligonukleotideja, jotka on suunnattu sekvenssiä vastaan, joka on erittäin homologinen Bcl-2:n ja Bcl-xL:n mRNA:ssa, mutta puuttuu Bcl-xS:n mRNA:sta (Zangemeister-Wittke ym., 2000). Sekä Bcl-2:n että Bcl-xL:n samanaikainen alaregulaatio indusoi apoptoosia ja lisäsi kemosensitiivisyyttä erilaisissa syöpäsoluissa (Gautschi ym., 2001; Tortora ym., 2003; Milella ym., 2004; Yamanaka ym., 2005).

Lisäksi kehitettiin BH3-domeenipeptidejä tai synteettisiä pienimolekyylisiä inhibiittoreita, jotka kohdistuivat antiapoptoottisiin Bcl-2:n kaltaisiin proteiineihin. BH3-domeeni koostuu yhdeksän amfipaattisesta amfipaattisesta α-kierteestä, joka sitoutuu Bcl-2:n kaltaisten proteiinien hydrofobiseen taskuun (Cory ja Adams, 2002). Vastaavasti BH3-domeenin peptidit pyrkivät häiritsemään tätä kompleksia ja siten herkistämään syöpäsoluja apoptoosille (Letai ym., 2002). Lisäksi Bidin BH3-domeenin korvaaminen ei-luonnollisilla aminohapoilla vuorovaikutusalueen vastakkaisella pinnalla hiilivetyjen nitomisen avulla johti vakautettuihin BH3-peptideihin, joita kutsutaan SAHB:ksi (stabilized α-helix of Bcl-2 domains) ja joilla on paremmat farmakologiset ominaisuudet (Walensky et al., 2004). Nämä stabiloidut BH3-peptidit laukaisivat apoptoosin useissa leukemiasolulinjoissa ja estivät myös leukemian ksenotransplantaattien kasvua hiirissä ilman haitallisia sivuvaikutuksia (Walensky ym., 2004).

Ei ole myöskään tunnistettu useita pieniä molekyyliyhdisteitä, jotka häiritsevät Bcl-2/Bcl-xL:n toimintaa. Seulomalla kemiallista kirjastoa yhdisteiden löytämiseksi, jotka pystyvät sitoutumaan Bcl-2-proteiinien BH3-taskuun, tunnistettiin HA14-1, yhdiste, joka kilpailee Bakin kanssa Bcl-2:een sitoutumisesta (Wang ym., 2000). Degterev et al. (2003) tunnistivat 16 320 ennalta valitun yhdisteen kirjastoa seulomalla kykyä syrjäyttää fluoresoiva Bakin BH3-peptidi Bcl-xL:stä fluoresoivassa polarisaatiomäärityksessä, ja he tunnistivat kaksi BH3-inhibiittoreiksi (BH3Is) kutsuttua aineluokkaa, jotka häiritsevät Bcl-xL:n kompleksia Bax:n ja Bad:n kanssa myös ehjissä soluissa.

Ydinmagneettiseen resonanssiin (NMR) perustuvalla seulonnalla, rinnakkaissynteesillä ja rakenteeseen perustuvalla suunnittelulla löydettiin äskettäin antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2, Bcl-X(L) ja Bcl-w pienimolekyylinen inhibiittori, ABT-737. ABT-737 oli tehokas yksittäisenä aineena tiettyjä lymfoomia ja kiinteitä kasvaimia vastaan ja osoitti synergististä sytotoksisuutta kemoterapian ja säteilyn kanssa (Oltersdorf ym., 2005).

Smac/DIABLO-agonistit

Potentiaalisesti terapeuttisten pienten molekyylien suunnittelussa XIAP:hen kohdistuvaksi vaikutteeksi eniten huomiota on kiinnitetty XIAP:n BIR3-domeenin sitoutumisuraan, johon Smac/DIABLO sitoutuu sen jälkeen, kun se on päässyt irti mitokondrioista. Rakenneanalyysi on tarjonnut selkeät perusteet sellaisten pienten yhdisteiden synteesille, jotka voivat jäljitellä Smac/DIABLO:n kaspaasi-9:n syrjäyttävää aktiivisuutta XIAP:n BIR3:sta (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). Solunsisäisen kulkeutumisen tehostamiseksi Smac-peptidit yhdistettiin kantajaan, esimerkiksi HIV:n Tat-proteiinin proteiinin transduktiomotiiviin (Fulda et al., 2002), Drosophila antennapaedian penetratiinisekvenssiin (Arnt et al., 2002) tai polyarginiinijatkokseen (Yang et al., 2003b). Kypsän Smac/DIABLO:n N-terminaalia edustavan heptapeptidin, joka on välttämätön XIAP:hen sitoutumiselle, raportoitiin edistävän kaspaasiaktivaatiota ja herkistävän erilaisia kasvainsolulinjoja ja myös primaaripotilaista peräisin olevia kasvainsoluja kuoleman reseptoriligatoinnin tai sytotoksisten lääkkeiden aiheuttamalle apoptoosille (Fulda ym., 2002). Tärkeää on, että Smac-peptidit jopa lisäsivät TRAIL:n kasvainvastaista aktiivisuutta in vivo kallonsisäisessä pahanlaatuisen gliooman ksenograft-mallissa (Fulda ym., 2002b). Samoin 8-merkkinen peptidi (AVPIAQKS), joka oli fuusioitu Drosophila antennapaedian penetratiinin proteiininsiirtodomeeniin, pystyi tunkeutumaan rintasyöpäsoluihin, sitomaan XIAP:tä ja cIAP1:tä ja voimistamaan kaspaasiaktiivisuutta, jonka aiheuttivat useat syöpälääkkeet, mukaan luettuina paklitakseli, etoposidi, 7-etyyli-10-hydroksikamptotetosiini (SN-38) ja doksorubisiini (Arnt ym., 2002). Lisäksi XIAP BIR3:n kanssa kompleksissa olevan Smac/DIABLO:n kolmiulotteisen rakenteen perusteella suunniteltiin Smac-peptidomimeettejä, jotka tekivät yhteistyötä TRAIL:n, TNFα:n, sisplatiinin tai etoposidin kanssa laukaistakseen apoptoosin kasvainsoluissa (Li ym., 2004; Sun ym., 2004a, 2004b, 2005).

Sittemmin XIAP:n ei-peptidisiä pienimolekyylisiä antagonisteja, jotka johdettiin seulomalla faagikirjastosta tai polyfenyyliurea-kirjastosta, kehitettiin IAP:n kohdentamiseen (Schimmer ym., 2004; Wang ym., 2004). Lisäksi japanilaisesta Ardisia-yrtistä peräisin oleva luonnontuote embeliini löydettiin hiljattain XIAP:n solun läpäiseväksi, ei-peptidiseksi, pienimolekyylipainoiseksi XIAP:n estäjäksi perinteisen kasvirohdosvalmisteen kolmiulotteisen rakennetietokannan rakenteeseen perustuvalla laskennallisella seulonnalla (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Embeliinin osoitettiin tehokkaasti kumoavan XIAP:n suojaavan vaikutuksen eturauhassyöpäsoluissa, joissa XIAP:n endogeeninen määrä on suuri, tai XIAP:llä transfektoiduissa Jurkat-soluissa sitoutumalla XIAP:n BIR3-domeeniin (Nikolovska-Coleska ym., 2004). Näin ollen Smac-agonistit tai pienimolekyylipainoiset XIAP-antagonistit voivat olla lupaavia syöpähoitokandidaatteja tehostamalla sytotoksisten hoitojen tehoa valikoivasti syöpäsoluissa.