Fluoresoivia proteiineja A. victoria -lajista
GFP:n tai sen varianttien spektriominaisuudet perustuvat kromoforin muodostavaan aminohapporakenteeseen (kuva 1). Tämä voi olla kolme aminohappoa paikoissa 65-67 tai lähellä tätä paikkaa olevia jäämiä (esim. YFP). Tärkeimpien kromoforiin liittyvien mutaatioiden lisäksi tutkittiin myös muita paikkaohjattuja mutaatioita, joilla pyrittiin parantamaan muita tekijöitä, kuten proteiinin kypsymistä ja ilmentymistä heterologisissa solujärjestelmissä (esim. kodonien käyttö, proteiinin taittuminen fysiologisessa lämpötilassa). Huomattakoon, että A. victoria on suhteellisen alkeellinen merieliö, jolla ei ole ruumiinlämpöjärjestelmää.
Vaikka GFP onkin yksi suosituimmista FP:istä kirkkautensa ja korkean valonkestävyytensä vuoksi, sillä on kaksi päähaittaa. Ne ovat tietty herkkyys pH:lle ja lievä taipumus dimeroitua. Dimerisaatio tai oligomerisaatio on monien FP:iden ongelma. Niiden taipumus agglutinoitua keskenään voi aiheuttaa artefakteja tai väärintulkintoja fuusioituneen proteiinin sijainnista ja toiminnasta. Tutkijat ovat kuitenkin keksineet joitakin vastauksia tähänkin ongelmaan. Mutaatiot kriittisissä paikoissa (F223R, L221K ja A206K), joissa poolittomat aminohapot on korvattu hydrofiilisillä, vähentävät dimeroitumista. Kaikki geneettiset muutokset, jotka johtavat sekä spektristen että käytännöllisten ominaisuuksien paranemiseen, on tiivistetty nimellä ”parannetut” FP:t.
WtGFP:n tapauksessa parannukset johtavat EGFP:hen (enhanced GFP), jolla on yksi herätepiikki 488 nm:ssä aiemman monimutkaisen absorptiospektrin sijasta 395 nm:ssä ja 475 nm:ssä. Roger Tsien et al. kehittämä ensimmäinen muunnettu versio wtGFP:stä (S65T-mutantti) oli viisi kertaa kirkkaampi kuin alkuperäinen ja sen kypsymisaika oli lyhyempi. Yhdessä toiseen mutaatioon (F64L) perustuvan paremman kypsymistehokkuuden kanssa 37 °C:ssa tällä on tärkeä merkitys eläviä soluja tarkasteleville ihmisille.
Erittäin mielenkiintoinen GFP-muunnos, jolla on yksi suurimmista Stokesin siirtymistä, on Sapphire. Mutaatio lähellä kromoforia olevassa kohdassa (T203I) johtaa siihen, että eksitaatiomaksimi muuttuu 399 nm:iin ja emissiomaksimi 511 nm:iin. Tämä on 112 nm:n Stokes-siirtymä. Emerald on toinen GFP-modifikaatio, jolla on parempi fotostabiilisuus ja kirkkaus sekä tehokkaampi taittuminen nisäkässoluissa.
Kaikkien vihreiden fluoresoivien proteiinien kirkkaus on suhteellisen suuri, mutta sinisten fluoresoivien proteiinien emissiovoimakkuus heikkenee yleensä mikroskooppisissa sovelluksissa. Niitä käytetään kuitenkin optisissa määrityksissä muiden spektriominaisuuksiensa vuoksi. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein, parannettu sinistä fluoresoiva proteiini) muodostettiin muuntamalla wtGFP:tä useilla mutaatiokierroksilla. Ensimmäinen (Y66H) jätti emissiohuipun pois vihreästä spektristä siniseen spektriin. Sitä seurasi lisää mutaatioita, jotka tuottivat proteiinin, jonka eksitaatiomaksimi on 380 nm:ssä ja emissiomaksimi 448 nm:ssä. Nämä spektriominaisuudet tekevät siitä EGFP:n kumppanin FRET-mikroskopiassa. Uusimpia sinisiä fluoresoivia proteiineja, joilla on suurempi kvanttituotto ja parempi fotostabiilisuus, ovat Azurite, SBFP2 ja EBFP2. EBFP:n lupaava seuraaja on Sirius-niminen proteiini, josta tuli suosittu, koska se sietää hyvin hyvin pH:ta (stabiili pH:sta 3-9) ja sillä on maine fluoresoivana proteiinina, jolla on toistaiseksi lyhin emissioaallonpituus.
Toisen ”sinisen” luokan GFP-variantteja muodostavat syaaniset fluoresoivat proteiinit: CFP:t. Tyrosiinin korvaaminen tryptofaanilla (Y66W) ja muut geneettiset muutokset johtavat fluorokromiin, jonka kirkkaus ja fotostabiilisuus ovat parantuneet. Tällä ECFP:llä on bimodaalinen heräte- ja emissiospektri 433/445 nm:ssä ja 475/503 nm:ssä. Kirkkaus on vain noin 40 prosenttia EGFP:n kirkkaudesta. Eräs merkittävä ECFP-muunnos on Cerulean, jonka ekstinktiokerroin ja kvanttituotto ovat korkeammat. Se on 1,5 kertaa kirkkaampi kuin ECFP, ja sitä käytetään FRET-kumppanina YFP:n kanssa.
GFP:n mutaatio, joka ei suoraan muuta yhtä kromoforin kolmesta keskeisestä aminohaposta, johti keltaisten fluoresoivien proteiinien syntymiseen. YFP:llä on yhteinen treoniini asemassa 203, joka on vaihdettu tyrosiiniin (T203Y). Tämä aminohappo on osa β-tynnyriä ja sijaitsee kromoforin välittömässä läheisyydessä. GFP:hen verrattuna heräte- ja emissio-ominaisuudet ovat siirtyneet pidemmille aallonpituuksille, ja heräte- ja emissiomaksimit ovat 514 nm:ssä ja 527 nm:ssä (EYFP). Yksi EYFP:n ominaisuuksista on sen pH-herkkyys. pH:ssa 6,5 EYFP:n fluoresenssi on vain noin 50 prosenttia sen fluoresenssista, mikä ei aina ole haitta. Kun on kyse pH:n mittaamisesta (esim. vesikkelit, endosomit jne.), EYFP:tä voidaan käyttää indikaattorina. Mielenkiintoista on, että uusi mutaatio (Q69M) paransi haponkestävyyttä ja kirkkautta huomattavasti (75 % kirkkaampi kuin EGFP). Tämä proteiini, jolla on edelleen huono valonkestävyys EGFP:hen verrattuna, sai nimekseen Citrine. Toinen YFP-mutantti (F46L) osoitti huomattavasti nopeampaa kypsymisnopeutta ja myös parempaa pH-kestävyyttä. Tämä proteiini nimettiin Venukseksi, ja se on usein FRET-akseptori Ceruleanin kanssa.