Kirjahylly

Esimerkkivaatimukset ja menettely

ELISA-tutkimukset tehdään polystyreenilevyissä, tyypillisesti 96-kuoppalevyissä, jotka on päällystetty siten, että ne sitovat proteiinia erittäin voimakkaasti. ELISA-tyypistä riippuen testaus vaatii primaarisen ja/tai sekundaarisen detektiovasta-aineen, analyytin/antigeenin, päällystysvasta-aineen/antigeenin, puskurin, pesun ja substraatin/kromogeenin. Ensisijainen detektiovasta-aine on spesifinen vasta-aine, joka sitoutuu vain kiinnostavaan proteiiniin, kun taas toissijainen detektiovasta-aine on toinen entsyymikonjugoitu vasta-aine, joka sitoutuu ensisijaiseen vasta-aineeseen, joka ei ole entsyymikonjugoitu.

ELISA-immunomäärityksen suorittamisessa on neljä yleistä päävaihetta. Nämä vaiheet ovat:

1. päällystäminen (joko antigeenillä tai vasta-aineella)

2. salpaaminen (yleensä lisäämällä naudan seerumin albumiinia ).

3. Havaitseminen
4. Loppulukema

   Havaitseminen tapahtuu lisäämällä substraattia, joka voi tuottaa väriä. ELISA-detektiossa käytettäviä substraatteja on saatavilla useita. Yleisimmin käytetään kuitenkin piparjuuriperoksidaasia (HRP) ja emäksistä fosfataasia (ALP). HRP:n substraatti on vetyperoksidi, ja se aiheuttaa sinisen värimuutoksen. ALP mittaa nitrofenolin keltaista väriä huoneenlämpöisen 15-30 minuutin inkubaatioajan jälkeen ja käyttää yleensä substraattina P-nitrofenyylifosfaattia (pNPP).

   Kunkin edellä mainitun neljän vaiheen välillä levy ”pestään” käyttämällä puskuria, kuten fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta (PBS, phosphate-buffered saline) ja ionittomia detergenttejä, sitoutumattoman materiaalin poistamiseksi. Kuopat pestään kaksi tai useampia kertoja jokaisen pesuvaiheen aikana, riippuen noudatettavasta erityisestä protokollasta.

   ELISA-protokollassa levyn kuoppiin sijoitetaan yleensä konsentraatioiden sarjalaimennos. Kun tulokset on mitattu, sarjalaimennosten tiedoista piirretään standardikäyrä, jossa konsentraatio on x-akselilla käyttäen log-asteikkoa ja absorbanssi y-akselilla käyttäen lineaarista asteikkoa.

   ELISA-tyyppejä on neljä päätyyppiä:

   • Suora ELISA (antigeenillä päällystetty levy; vasta-aineen seulonta)

   • Suora ELISA (antigeenillä päällystetty levy; antigeenin/vasta-aineen seulonta)

   • Sandwich ELISA (vasta-aineella päällystetty levy; seulonta-antigeeni)
   • Kilpaileva ELISA (seulonta-vasta-aine)

     Suora ELISA

     Kaikki suorat ja epäsuorat ELISA-tutkimukset alkavat antigeenin päällystämisellä ELISA-levyille. Ensimmäisessä sitoutumisvaiheessa antigeeni lisätään levyille, joita inkuboidaan tunnin ajan 37 asteessa C tai voidaan inkuboida 4 asteessa C yön yli. Kun inkubointivaihe on päättynyt, seuraavassa vaiheessa levyt pestään mahdollisista sitoutumattomista vasta-aineista ja estetään mahdolliset sitoutumattomat kohdat ELISA-levyllä käyttämällä aineita, kuten BSA:ta, ovalbumiinia, aprotiniinia tai muita eläinproteiineja. Tämä toinen vaihe on tärkeä, koska se estää epäspesifisten vasta-aineiden sitoutumisen levyyn ja minimoi väärät positiiviset tulokset. Puskurin lisäämisen jälkeen levy pestään uudelleen ja lisätään valittu entsyymikonjugoitu primäärinen detektiovasta-aine. Levyä inkuboidaan edelleen tunnin ajan.

     Suorassa ELISA-testissä primäärinen detektiovasta-aine sitoutuu suoraan kiinnostavaan proteiiniin. Seuraavaksi levy pestään uudelleen sitoutumattoman vasta-aineen poistamiseksi, minkä jälkeen levylle lisätään substraatti/kromofori, kuten emäksinen fosfataasi (AP) tai piparjuuriperoksidaasi (HRP), joka saa aikaan värinmuutoksen. Näytteen värimuutos tapahtuu joko AP:n suorittaman substraatin fosfaattiryhmien hydrolyysin tai HRP:n suorittaman substraatin hapettumisen seurauksena. Suoran ELISA-testin etuna on muun muassa se, että sekundäärivasta-aineiden ristireaktiivisuus poistuu ja että se on nopeampi epäsuoraan ELISA-testiin verrattuna, koska siinä on vähemmän vaiheita. Sen haittapuolia ovat sen alhainen herkkyys muihin ELISA-tyyppeihin verrattuna ja sen korkeat reaktiokustannukset.

     Epäsuora ELISA

     Epäsuoran ELISA:n vaiheet ovat identtiset suoran ELISA:n kanssa lukuun ottamatta ylimääräistä pesuvaihetta ja vasta-ainetyyppejä, jotka lisätään puskurin poistamisen jälkeen. Epäsuorassa ELISA:ssa tarvitaan kaksi vasta-ainetta, ensisijainen detektiovasta-aine, joka tarttuu kiinnostavaan proteiiniin, ja toissijainen entsyymisidonnainen vasta-aine, joka on komplementaarinen ensisijaisen vasta-aineen kanssa. Ensisijainen vasta-aine lisätään ensin, minkä jälkeen suoritetaan pesuvaihe, minkä jälkeen entsyymikonjugoitu toissijainen vasta-aine lisätään ja inkuboidaan. Tämän jälkeen vaiheet ovat samat kuin suorassa ELISA:ssa, joka sisältää pesuvaiheen, substraatin lisäämisen ja värimuutoksen havaitsemisen.

     Epäsuoralla ELISA:lla on suurempi herkkyys verrattuna suoraan ELISA:han. Se on myös edullisempi ja joustavampi, koska siinä voidaan käyttää monia mahdollisia primaarivasta-aineita. Ainoa merkittävä haittapuoli tässä ELISA-tyypissä on sekundääristen detektiovasta-aineiden ristireaktiivisuuden riski.

     Sandwich-ELISA

     Toisin kuin suorassa ja epäsuorassa ELISA:ssa, sandwich-ELISA:ssa sieppausvasta-aine päällystetään levyn kuoppiin. Sitä kutsutaan ”sandwichiksi”, koska antigeenit ovat kahden vasta-ainekerroksen (sieppaus- ja detektiovasta-aineet) välissä. Kun sieppausvasta-aine on lisätty levyille, levyt peitetään ja inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa. Kun päällystysvaihe on päättynyt, levyt pestään PBS:llä ja puskuroidaan/blockataan BSA:lla. Puskuripesuja tehdään vähintään 1-2 tuntia huoneenlämmössä. Lopuksi levy pestään vielä kerran PBS:llä ennen antigeenin lisäämistä.

     Kiinnostava antigeeni lisätään sitten levyille sitoutumaan kaappausvasta-aineeseen ja inkuboidaan 90 minuuttia 37 asteessa C. Levy pestään uudelleen, minkä jälkeen primäärinen detektiovasta-aine lisätään levylle ja inkuboidaan vielä 1-2 tuntia huoneenlämmössä, minkä jälkeen tehdään puskuripesu. Sitten lisätään sekundaarinen entsyymikonjugoitu vasta-aine ja inkuboidaan vielä 1-2 tuntia. Levy pestään uudelleen ja substraatti lisätään värimuutoksen aikaansaamiseksi. Sandwich-ELISA:lla on kaikista ELISA-tyypeistä suurin herkkyys. Tämän ELISA-tyypin suurimmat haitat ovat aika ja kustannukset sekä ”sovitetun parin” (divalentti/multivalentti antigeeni) ja sekundääristen vasta-aineiden välttämätön käyttö.

     Kilpailullinen ELISA

     Kilpailullisella ELISA:lla testataan antigeeneille spesifisen vasta-aineen esiintymistä testiseerumissa. Tässä ELISA-tyypissä käytetään kahta spesifistä vasta-ainetta, entsyymikonjugoitua vasta-ainetta ja toista testiseerumissa olevaa vasta-ainetta (jos seerumi on positiivinen). Kahden vasta-aineen yhdistäminen kuoppiin mahdollistaa kilpailun antigeeniin sitoutumisesta. Värimuutos tarkoittaa, että testi on negatiivinen, koska entsyymikonjugoitu vasta-aine sitoi antigeenit (ei testiseerumin vasta-aineita). Värin puuttuminen tarkoittaa positiivista testiä ja vasta-aineiden esiintymistä testiseerumissa. Kilpailevan ELISA-testin spesifisyys on alhainen, eikä sitä voida käyttää laimeissa näytteissä. Etuna on kuitenkin se, että näytteen puhdistusta tarvitaan vähemmän, sillä voidaan mitata suuri määrä antigeenejä tietyssä näytteessä, sitä voidaan käyttää pienille antigeeneille ja sen vaihtelu on vähäistä.