Kudosten fiksaation merkitys
Kudosten tutkimiseksi mikroskoopilla ne on säilöttävä (fiksoitava) ja leikattava tarpeeksi ohuiksi paloiksi, jotta ne ovat läpikuultavia. Kiinnittäminen on kriittinen vaihe histologisten leikkeiden valmistuksessa. Jos sitä ei suoriteta optimaalisissa olosuhteissa tai jos kiinnittäminen viivästyy, kudosnäyte voi vahingoittua peruuttamattomasti. Riippumatta siitä, kuinka huolellisesti kudoksen käsittelyä, mikrotomiaa ja värjäystä myöhemmin tehdään, näytteestä saatava morfologinen ja histokemiallinen informaatio vaarantuu.
Kudosten fiksaation laajana tavoitteena on säilyttää solut ja kudoskomponentit ”elävän kaltaisessa tilassa” tai mahdollisimman vähän elävää kudosta muuttaen, ja tehdä tämä siten, että ohuiden, värjättyjen leikkeiden valmistaminen on mahdollista. Fiksatiivin ja fiksaatioprotokollan valinta voi riippua suunnitelluista lisäkäsittelyvaiheista ja lopullisista analyyseistä. Täydellistä fiksatiivia ei ole olemassa, vaikka formaldehydi onkin lähimpänä sitä. Sen vuoksi käytettävissä on erilaisia fiksatiiveja, jotka riippuvat kudostyypistä ja näytettävistä ominaisuuksista.
Fiksaatiotyyppi
Kudosten fiksaatio voidaan toteuttaa kemiallisin tai fysikaalisin keinoin.
Fysikaalisia menetelmiä ovat muun muassa kuumentaminen, mikroluovutus ja kryosäilytys (kylmäkuivaus).
Kemiallinen fiksaatio saavutetaan yleensä upottamalla näyte fiksatiiviin (immersiivinen fiksaatio) tai, jos kyseessä ovat pienet eläimet tai jotkin kokonaiset elimet, kuten keuhkot, perfusoimalla verisuonisto fiksatiivilla (perfuusiofiksaatio). Joissakin histokemiallisissa erityistoimenpiteissä fiksatiiveja on toisinaan käytetty höyryssä. Esimerkiksi paraformaldehydiä ja osmiumtetroksidia voidaan käyttää pakastekuivattujen kudosten höyryfiksointiin.
- Lisätietoa suosituista fiksatiiviliuoksista
Fiksaation mekanismi
Kemiallisen fiksaation kaksi pääasiallista mekanismia ovat ristisilloittuminen ja hyytyminen.
Ristisilloittumiseen liittyy kovalenttisten sidosten muodostuminen sekä proteiinien sisällä että niiden välillä, mikä saa kudoksen jäykistymään ja siten vastustamaan hajoamista.
Koagulaatio aiheutuu proteiinien dehydraatiosta alkoholien tai asetonin avulla. Nämä reagenssit poistavat ja korvaavat vapaata vettä soluissa ja kudoksissa ja aiheuttavat muutoksen proteiinien tertiäärirakenteessa horjuttamalla hydrofobisia sidoksia. Sitä kutsutaan myös denaturaatioksi.
Fiksaatioon vaikuttavat tekijät
- Lämpötila: Yleisesti ottaen lämpötilan nousu lisäsi kiinnittymisnopeutta, mutta lisäsi myös autolyysin ja soluelementtien diffuusionopeutta. Perinteisesti 0-4 °C:n lämpötilaa on pidetty ihanteellisena lämpötilana näytteiden kiinnittämiselle. Nyt fiksaatio suoritetaan rutiininomaisesti huoneenlämmössä.
- Koko: 1-4 mm paksuus
- Tilavuuden suhde: Vähintään 15-20 kertaa suurempi kuin kudoksen tilavuus
- Aika: 24 – 48 tuntia
- pH: Olisi pidettävä fysiologisella alueella, välillä pH 4-9. Ultrastruktuurin säilyttämistä varten pH:n olisi oltava puskuroitu välillä 7,2-7,4.
Protokollat
- Luuaineksen kalkinpoistomenetelmät ja -protokollat
- Standardiprotokolla formaliinifiksoitua parafiiniin upotettua kudosta varten
Hyödylliset linkit
- Fiksaatioprosessi ja fiksaatio. Fixatiivien luonne
- Populaariset fiksatiiviliuokset
- Perusteellinen johdatus histologiaan
- National Society for Histotechnology
- Johdatus kalkinpoistoon
- Käytännön opas hyvään histologiseen käytäntöön