Malassezia furfurin eristäminen kissalta

Malassezia-suku koostuu lipofiilisistä hiivasienistä, joiden tiedetään kuuluvan ihmisen ihon ja monien nisäkkäiden ja lintujen mikroflooraan ja joita eristetään harvoin ympäristöstä (11). Näiden hiivojen tyypillinen fysiologinen ominaisuus on käyttää lipidiä hiilen lähteenä. Malassezia pachydermatis -hiivasukuun kuuluvaa lajia lukuun ottamatta muut Malassezia-suvun lajit tarvitsevat in vitro -kasvuunsa pitkäketjuisia (C12-C24) rasvahappoja. Näiden hiivojen taksonomia on aina ollut kiistanalainen (8). Muutama vuosi sitten hyväksytyt lajit olivatM. furfur (Robin) Baillon 1889 ja M. pachydermatis (Weidman) Dodge 1935. Viime aikoina sukua on tarkistettu molekyylitietojen ja lipidivaatimusten perusteella, ja se on laajennettu käsittämään seitsemän lajia: M. furfur, M. pachydermatis, M. sympodialis, M. globosa, M. obtusa, M. restricta ja M. slooffiae (4).

M. furfur on tunnetusti opportunistinen ihon patogeeni ihmisillä. Se on pityriasis versicolor, pityriasis capitis, seborrooinen ihottuma ja follikuliitti. Malassezia-lajien merkitys on kuitenkin kasvamassa uusina taudinaiheuttajina, koska niiden on kuvattu aiheuttavan systeemisiä infektioita immuunipuutteisilla potilailla ja vastasyntyneillä, jotka saavat suonensisäisesti lipidiä (1, 12). Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia sellaisten kissojen ulkokorvakäytävien lipofiilistä mikrobistoa, joilla ei ole ulkokorvatulehdusta. Tässä artikkelissa kuvataan ensimmäinen M. furfur -bakteerin eristys kissasta.

33 kotieläinkissan (17 urosta ja 16 naarasta) ulkoisista korvakäytävistä, joilla ei ollut ulkokorvatulehdusta, otettiin näytteet pyyhkäisyllä. Näytteet viljeltiin Sabouraud-glukoosiagarilla (SGA; Biolife s.r.l., Milano, Italia), SGA:ssa, jota oli täydennetty oliiviöljyllä (10 ml/litra), ja Leemingin väliaineessa (10 g peptonia, 5 g glukoosia, 0,1 g hiivauutetta, 4 g kuivattua häränsappea, 1 ml glyserolia, 0,5 g glyserolimonostearaattia, 0,5 ml Tween 60:tä, 10 ml lehmän täysrasvaista maitoa, 12 g agaria litraa kohti, pH 6,2) (9). Kaikki väliaineet sisälsivät 0,05 % kloramfenikolia ja 0,05 % sykloheksimidiä. Kukin kerumin preparaatti lämpökiinnitettiin, värjättiin Diff-Quickilla ja tutkittiin mikroskooppisesti tyypillisten Malassezia-solujen esiintymisen varalta. Levyjä inkuboitiin 35 °C:ssa ja tutkittiin 3, 5, 7 ja 14 päivän kuluttua. Kun kasvua havaittiin, valittiin viisi erilaista pesäkettä oliiviöljyllä täydennetystä SGA:sta ja Leemingin väliaineesta ja subkulturoitiin SGA:ssa niiden lipidiriippuvuuden määrittämiseksi. M. pachydermatis tunnistettiin mikroskooppisen morfologian ja SGA:lla kasvamisen perusteella. Lipidiriippuvaisten hiivojen tunnistaminen perustui Guillot et al. (7) ehdottamaan Tween-diffuusiotestiin, Cremophor EL -assimilaatiotestiin ja Mayser et al. (10) kuvailemaan eskuliinin pilkkomiseen, ja kontrollina käytettiin seuraavia tyyppikantoja: M. furfur CBS 1878T, M. furfur CBS 7019NT (jossa NT tarkoittaa neotyyppiä), M. sympodialis CBS 7222T, M. slooffiae CBS 7956T, M. globosa CBS 7966T ja M. obtusa CBS 7876T (ystävällisesti toimittaneet E. Guého ja J. Guillot). Tween-diffuusiotestin avulla voidaan erottaa toisistaan lipidiriippuvaiset lajit sen mukaan, kuinka hyvin ne kykenevät assimiloimaan erilaisia polyoksietyleenisorbitaaniestereitä (Tweens 20, 40, 60 ja 80). Cremophor EL sisältää risiiniöljyä ja risiinihappoa, ja sitä käytetään ylimääräisenä avainmerkkinä M. furfur-, M. slooffiae- ja M. sympodialis -lajien erottelussa.

Tyyppisiä Malassezia-soluja oli havaittavissa Diff-Quick-värjätyissä preparaateissa, jotka oli otettu seitsemästä kissasta peräisin olevasta kerumiinista, mutta vain viisi näistä näytteistä osoittautui positiiviseksi viljelmällä. Malassezia-lajeja eristettiin seitsemästä kissasta (21,2 %), mutta kahdessa näistä kissoista otetussa Diff-Quick-värjätyssä preparaatissa ei havaittu tyypillisiä Malassezia-soluja. Muihin lajeihin kuuluvia hiivoja ei eristetty. Kuudesta kissasta (18,1 %) eristettiin ensimmäisen inkubaatioviikon aikana ainoastaan M. pachydermatis (kolme isolaattia kasvatettiin kolmen päivän kuluttua, kaksi viiden päivän kuluttua ja yksi seitsemän päivän kuluttua). Vain yhdestä kissasta eristettiin lipidiriippuvainen laji 7 päivän inkubaation jälkeen. Tämä isolaatti muodosti kermanvärisiä, sileitä ja umbonaattisia pesäkkeitä, joiden keskimääräinen halkaisija oli 4,3 mm modifioidulla Dixon-agarilla (36 g mallasuutetta, 6 g peptonia, 20 g kuivattua häränsappea, 10 ml Tween 40:tä, 2 ml glyserolia, 2 ml öljyhappoa, 12 g agaria litraa kohti, pH 6,0) (4) 7 päivän inkuboinnin jälkeen 32 °C:ssa. Rakenne oli mureneva, ja solut olivat soikeita tai pallomaisia (1,5-3,0 μm x 1,5-4 μm). Nuppuja muodostui leveään pohjaan, ja joissakin soluissa näkyi lyhyitä säikeitä. Katalaasireaktio oli positiivinen. Tämä isolaatti käytti neljää Tweenia (20, 40, 60 ja 80), assimiloi Cremophor EL:ää ja oli heikosti positiivinen eskuliinin pilkkomisen suhteen, kuten tyyppikannat M. furfur CBS 1878T ja M. furfur CBS 7019NT (kuva 1). Näiden löydösten perusteella tämä lipidiriippuvainen hiiva tunnistettiin M. furfuriksi(7, 10).