MRNA:n entsymaattinen muuntaminen kaksijuosteiseksi insertti-DNA:ksi voidaan toteuttaa useilla eri menetelmillä. Kaikkiin niistä liittyy käänteisen transkriptaasin toiminta ja oligonukleotidilla käynnistetty cDNA:n synteesi. Tämän jälkeen yleisesti käytössä olevat menettelyt eroavat huomattavasti toisistaan. On olemassa useita menetelmiä toisen säikeen syntetisoimiseksi ja useita menetelmiä kloonattavissa olevan DNA:n valmistukseen soveltuvien päätteiden tuottamiseksi. Näiden menettelyjen päätavoitteet ovat mahdollisimman pitkän insertti-DNA:n rakentaminen siten, että mRNA:n muuntaminen DNA:ksi, joka voi ligatoida vektori-DNA:han, on hyvin tuottoisaa. Seuraavat menettelyt edellyttävät vain kaupallisesti saatavilla olevia reagensseja, ja niillä onnistutaan yleensä tuottamaan hyviä cDNA-kirjastoja. Perusprotokollassa kuvataan menetelmä, jolla valmistetaan tylppäpäätteistä cDNA:ta, joka voidaan sitten ligoida linkkereihin, jotta se voidaan myöhemmin kloonata ainutlaatuiseen restriktiokohtaan, kuten EcoRI:hen. Vaihtoehtoinen protokolla on muunnelma, joka vaatii vähemmän entsymaattisia manipulaatioita ja mahdollistaa suunnattujen cDNA-kirjastojen rakentamisen, mikä on erityisen toivottavaa, kun tavoitteena on tuottaa ekspressio-cDNA-kirjastoja. Vaihtoehtoisessa protokollassa hyödynnetään linkkeriprimeria, joka koostuu (järjestyksessä 3′:sta 5′:een) oligo(dT)-alukkeesta, XhoI-endonukleaasin restriktiokohdasta ja (GA)20-toistosta restriktiokohdan suojaamiseksi tylppäpäätteisen cDNA:n tuottamisen aikana. Yksittäisten cDNA-molekyylien sisäiset XhoI-kohdat suojataan lisäämällä 5-metyyli-dCTP:tä ensimmäisen säikeen nukleotidiseokseen. Tuloksena syntyneet cDNA:t, joilla on yksilölliset päät, voidaan kloonata EcoRI /XhoI -digestoituihin vektoreihin sen jälkeen, kun EcoRI-adapterit on ligitoitu 5′-päähän ja XhoI-digestio on suoritettu 3′-XhoI-kohtien vapauttamiseksi, jotka linkkeri-primeri on sisällyttänyt cDNA:han. Nämä muutokset johtavat huomattavasti virtaviivaistettuun menettelyyn, joka on huomattavasti nopeampi ja helpompi kuin perusprotokolla.
Localizador
Blog Network
