Mycobacterium smegmatis recX:n funktionaalisen roolin selvittäminen stressivasteessa

Hypoksia aiheuttaa M. smegmatis recA- ja recX-geenejä

Infektion ja lisääntymisen aikana M. tuberculosis altistuu fysiologisille stressiolosuhteille, kuten hypoksialle ja happamalle pH-stressille, jotka voivat vaarantaa sen selviytymisen38,39,40. Esimerkiksi akuutti hypoksinen stressi pysäyttää DNA:n replikaation ja aiheuttaa voimakkaita DNA-vaurioita41,42,43. SOS-reitin geenien, kuten umuDC:n, polB:n, recN:n, sulA:n, uvrA:n, uvrB:n ja uvrD:n, ilmentyminen lisääntyy DNA-vaurion yhteydessä44,45,46. Tätä varten hypoksian aiheuttaman geeniekspression profilointi M. smegmatis -bakteerissa ja M. tuberculosis -bakteerissa latentin infektion aikana on antanut arvokasta tietoa latenttien tuberkuloosibasillien luonteesta ja sen hoidosta47.

Varhaisemmat tutkimukset M. tuberculosis -bakteerissa48, Thiobacillus ferrooxidansissa49 ja Streptomyces lividansissa50 ovat osoittaneet, että recA:ta transkriboidaan yhdessä recX:n kanssa. Lisäksi RecA:n (SOS-vasteen positiivinen säätelijä) yliekspression havaittiin olevan myrkyllistä RecX:n puuttuessa tietyissä bakteerilajeissa, kuten Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 ja Xanthomonas oryzae53. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa sen käsityksen kanssa, että RecX toimii anti-rekombinaasina tukahduttaakseen RecA14:n edistämiä epäasianmukaisia rekombinaatiotapahtumia. Sitä vastoin RecA:n yliekspressio E. coli ΔrecX -kannassa ei ole haitallinen eikä recX:n poisto vaikuta recA:n ilmentymiseen54. RecX:n transkriptio E. colissa on alasreguloitunut verrattuna recA:han normaaleissa kasvuolosuhteissa, koska recA:n ja recX:n koodaavien sekvenssien välissä on transkription lopetuskohta. Transkription läpilukemisen tuloksena syntyvä recA-recX-mRNA-transkriptio kerääntyy kuitenkin noin 5-10 prosenttiin recA:n mRNA:n kokonaispitoisuudesta54. recX-transkriptiota oli tuskin havaittavissa E. colin vegetatiivisen kasvun aikana, mutta recX:n voimakasta ilmentymistä tapahtuu DNA:ta vahingoittavien aineiden käsittelyn jälkeen15,55.

Sekä M. smegmatis että M. tuberculosis -bakteerin genomit sisältävät kumpikin yhden kopion recA:sta ja recX:stä yhdessä operonissa. Näiden geenien ilmentymisen ja säätelyn tutkimiseksi aerobisessa ja hypoksisessa kasvussa M. smegmatiksessa, joka on yleisesti käytetty M. tuberculosis -taudin korvikemalli, mitattiin mRNA:n suhteellinen runsaus eri kasvuvaiheissa RT-qPCR-määrityksellä ja normalisoitiin konstitutiivisesti ilmentyvän 16S rRNA-geenin runsaus. M. smegmatis recA- ja recX-mRNA:n syklikynnysarvot (Ct-arvot) normalisoitiin 16S rRNA-geenin Ct-arvoa vastaan. Toisin kuin E. coli15,55, recA-mRNA:n transkriptioita havaittiin merkittävä määrä varhaisessa log-vaiheessa sekä aerobisissa että hypoksisissa viljelyolosuhteissa (kuva 1A). Mielenkiintoista oli, että hypoksiset olosuhteet lisäsivät recA mRNA:n kertymistä 1,5-kertaiseksi log-vaiheen puolivälissä ja vähenivät sen jälkeen, kun solut siirtyivät stationaarivaiheeseen. Samanlainen kuvio havaittiin recX mRNA:n runsaudessa sekä aerobisissa että hypoksisissa olosuhteissa, joskin pienemmillä tasoilla (kuva 1B). Nämä havainnot tukevat ajatusta siitä, että nämä kaksi geeniä kirjoitetaan yhdessä ja niitä säädellään koordinoidusti aerobisissa ja hypoksisissa kasvuolosuhteissa. Kummallista kyllä, mRNA:n määrissä ei havaittu eroa aerobisissa ja hypoksisissa kasvuolosuhteissa varhaisessa log-vaiheessa. M. smegmatiksen kasvuvaihespesifisten merkkigeenien (sigH2 ja sigH7)56 transkriptioprofiileja käytettiin varhaisen log-vaiheen, keskimmäisen log-vaiheen ja stationaarisen vaiheen ajankohtien määrittämiseen (kuva 1C). Monilääkeresistenteissä kliinisissä M. tuberculosis -kannoissa sekä recA:n että recX:n mRNA-tasojen todettiin olevan korkeammat kuin lääkkeille herkissä kannoissa, ja recX:n mRNA-tasot kasvoivat samanaikaisesti recA:n mRNA:n nousun kanssa57.

On kuitenkin huomattava, että mRNA-tasoja ei voida käyttää vastaavien proteiinitasojen korvikkeina. Siksi RecA- ja RecX-proteiinien runsaus M. smegmatis -bakteerissa mitattiin aerobisissa ja hypoksisissa olosuhteissa Western blot -määrityksellä käyttäen anti-RecA- ja anti-RecX-vasta-aineita. GroEL:ää käytettiin proteiinikuormituskontrollina. Immunoblottien densitometrinen analyysi osoitti, että solut keräsivät suurempia RecA-pitoisuuksia hypoksisissa kasvuolosuhteissa verrattuna aerobisiin olosuhteisiin (Kuva 2A,B). Vertaileva analyysi osoitti, että solut kerryttivät johdonmukaisesti 2-kertaisesti korkeampia RecA-tasoja log-vaiheen keskivaiheilla suhteessa log-vaiheen alkuvaiheeseen aerobisissa kasvuolosuhteissa, jotka vähenivät stationaarivaiheessa log-vaiheen alkuvaiheessa havaituille tasoille (Kuva 2A,B). RecX:n osalta havaittiin samanlainen kuvio, vaikkakin tasot eivät olleet yhtä voimakkaita kuin RecA:n osalta (kuvat 2A,C). Vaikka mRNA:n ja proteiinin ilmentymismallit olivat vertailukelpoisia, havaittiin merkittäviä eroja. Ensinnäkin RecX-proteiinia oli tuskin havaittavissa varhaisessa log-vaiheessa hypoksisissa olosuhteissa. Toiseksi RecA:n mRNA:n ja proteiinin runsaus oli suurempi kuin RecX:n.

Vaikkakin nämä tulokset viittaavat siihen, että M. smegmatis recA- ja recX-geenit indusoituvat hypoksisissa olosuhteissa, recX:n mRNA:n ja vastaavien proteiinien määrän välillä ei ole korrelaatiota varhaisessa log-vaiheessa. Sekä M. tuberculosis- että M. smegmatis -bakteerin on osoitettu stabiloivan mRNA-transkriptioitaan kasvua estävissä olosuhteissa58,59,60. Mahdollisista mekanismeista tRNA:n uudelleenohjelmoinnilla ja valikoivalla koodonivääristymällä translaatiolla on osoitettu olevan merkitystä mykobakteereissa vasteena hypoksiaan61. Yksi mahdollinen selitys sille, että recX:n mRNA- ja proteiinitason välillä ei ole korrelaatiota varhaisessa log-vaiheessa, voisi johtua recX-mRNA:n translaatiorepressiosta.

DrecX- ja ΔrecA ΔrecX-mutanttikantojen konstruointi

Ero RecA:n ja RecX:n proteiinipitoisuuksissa M. smegmatis -bakteerissa viittaa geenien ilmentymisen mahdolliseen säätelyyn transkriptiotasolla. Monissa tähän mennessä tutkituissa bakteereissa recX-geeni sijaitsee samalla koodaavalla säikeellä recA:n alapuolella ja nämä kaksi geeniä transkriboituvat yhdessä48,50,53,54,62,63. Xanthomonas-patogeenien lexA-recA-recX-lokuksessa kumpikin geeni ilmentyy kuitenkin omasta promoottoristaan64. Lisäksi D. radioduransissa65,66, B. subtiliksessa67 ja N. gonorrhoeae:ssa26 recA- ja recX-geenit on erotettu toisistaan useiden satojen kb:n pituisesti, ja ne transkriboituvat omilta promoottoreiltaan.

Monissa mykobakteerilajeissa sekä muutamissa muissa bakteereissa recX:ää koodaavan sekvenssin 5′-alue on päällekkäin recA-geenin 3′-alueen kanssa. Päällekkäisyys on 32 bp pitkä M. smegmatis -bakteerissa48 , kun taas M. tuberculosis -bakteerissa68 ja M. leprae -bakteerissa69 päällekkäisyys on 35 bp. RecX-deleetion vaikutusta fenotyyppisiin ominaisuuksiin on tutkittu eri organismeissa7,10. RecX:n tyrmäysmutantit osoittavat erilaisia RecA:n toimintoihin liittyviä fenotyyppejä: B. subtilis -bakteerin recX:n inaktivointi teki solut herkiksi MMS:lle ja H2O225:lle, S. lividans -bakteerin recX-mutantit osoittivat vähentynyttä resistenssiä UV-vaurioita vastaan42 ja N. gonorrhoeae -bakteerin recX-mutantti osoitti pientä vähenemistä kyvyssä selviytyä DNA-vaurioista, jotka aiheutuivat kaksoissäikeiden murtumista26. Sekä recA- että recX-geenien deletoinnin vaikutusta kasvuominaisuuksiin ja DNA-vaurioiden korjaamiseen ei kuitenkaan ole tutkittu missään organismissa. Lisäksi recX:n in vivo -roolia mykobakteereissa ei tunneta täysin.

Edelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että M. smegmatis ΔrecA -kannalla on herkkyyttä UV-indusoituneille DNA-vaurioille eikä se edistä HR:ää52. Yhdistimme recA-mutaation recX:n deleetioon tutkiaksemme kaksoismutaatioiden vaikutuksia. Tätä tarkoitusta varten luotiin M. smegmatis mc2155 recX single- ja recArecX-kaksoismutaatiokannat. Kontrollina M. smegmatis -bakteerin recA-deletoinnin vaikutus arvioitiin uudelleen suoraa vertailua varten. M. smegmatis mc2155 ΔrecA ja ΔrecAΔrecX -mutantit tuotettiin rekombinointimenetelmällä, joka perustuu M. tuberculosis ja M. bovis BCG28 -mutaatioita varten kehitettyyn protokollaan, käyttäen 3,279 kb:n ja 3,302 kb:n lineaarisia ΔrecA::hyg- ja ΔrecAΔrecX::hyg- AES-konstruktioita. Noin 100 ng lineaarisia AES-DNA-fragmentteja tuotettiin sulattamalla vastaavat plasmidit EcoRV:llä (kuva 3A). Nämä transformoitiin päteviin M. smegmatis mc2155:pJV53-rekombinoiviin soluihin70. 4-5 päivän inkubaation jälkeen ΔrecX- ja ΔrecAΔrecX-mutanteista löytyi 8-10 Hyg-resistenttiä pesäkettä. Oletetut mutanttikannat seulottiin PCR:llä sen määrittämiseksi, olivatko recX- ja recArecX-geenit poistuneet kromosomista (tietoja ei ole esitetty). Oikeat mutantit kasvatettiin 7H10 Middlebrook-agarmediumissa 5-8 sukupolven ajan, jotta pJV53:n häviäminen olisi mahdollista.

Genotyyppinen ja fenotyyppinen analyysi M. smegmatis ΔrecX- ja ΔrecAΔrecX-mutanttien analysointi

PCR-seulonnan jälkeen saatiin kaksi kumpaakin M. smegmatis mc2155:n ΔrecX- ja ΔrecAΔrecX- knockout-mutanttia. ΔrecX- ja ΔrecAΔrecX-mutantit karakterisoitiin restriktioentsyymikartoituksella ja Southern blot -hybridisaatiolla (kuva 3). Hybridisoitaessa sopivilla radiomerkityillä koettimilla havaittiin 4,1 kb:n fragmentti villityypin M. smegmatis mc2155-soluissa. Ennustetut 3,14 kb:n ja 2,09 kb:n fragmentit havaittiin vastaavasti ΔrecX- ja ΔrecAΔrecX-mutaatioissa (Kuva 3B,C). Molemmat nauhat ovat pienempiä kuin 4,1 kb, mikä osoittaa, että recX- ja recArecX-geenit on poistettu alleelien korvautumisen kautta. Alleelinvaihdon frekvenssi recX:n ja recArecX:n osalta oli 70 %:n ja 80 %:n välillä.

Yksi varoitus tämän analyysin suhteen on, että ΔrecX- ja ΔrecAΔrecX-mutaatioiden havaitut vaikutukset voivat johtua hygromysiiniresistenssigeenin insertion polaarisista vaikutuksista. Yleisesti ottaen geneettiset muutokset recA-recX-paikan ympärillä voivat johtaa polaarisiin vaikutuksiin recA-recX-paikan alapuolella olevien geenien ilmentymiseen. Mahdollisten polaaristen vaikutusten tutkimiseksi tehtiin kaksi riippumatonta koetta. Ensinnäkin ΔrecX- ja ΔrecAΔrecX-mutantteja täydennettiin recA- ja recX-geenien toimivilla kopioilla. Transformanttien kykyä kasvaa vakioviljelyalustassa ja suojata mutanttisoluja UV-säteilytykseltä arvioitiin. Kymmenkertaiset sarjalaimennokset tiputettiin 7H10-agarlevyille ja analysoitiin. Kuten kuvasta 4A,B käy ilmi, villityyppinen recA täydensi osittain ΔrecA- ja ΔrecAΔrecX-mutanttikantoja, kuten niiden kyvystä tukea kasvua ja antaa suojaa UV-säteilyä vastaan voidaan päätellä. Villiä tyyppiä oleva recX ei kuitenkaan pystynyt pelastamaan ΔrecAΔrecX-mutantti-kantojen fenotyyppiä, joka havaittiin DNA-vaurion indusoituessa UV-säteilyn avulla. Koska recX:n poistolla ei ollut havaittavaa vaikutusta sen kasvuun normaaleissa ja DNA-vaurio-olosuhteissa, ΔrecX ja sitä vastaava komplementoitu kanta osoittivat samanlaista kasvua kuin villityyppi.

Toiseksi arvioimme kahden M. smegmatis mc2155 geenit, gluD (MSMEG_2725) ja glnH (MSMEG_2726), jotka sijaitsevat recA recX-lokuksen alajuoksulla ΔrecA ΔrecX- ja ΔrecX-mutanttikannoissa verrattuna villiintyneeseen kantaan. Positiivisena kontrollina käytettiin M. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720) -geeniä, joka sijaitsee recA-recX-lokuksen ylävirtaan. Kokonais-RNA valmistettiin villityypin, ΔrecA ΔrecX- ja ΔrecX-mutaatiokannoista. Geenien transkriptien suhteelliset runsaudet määritettiin kvantitatiivisella RT-qPCR:llä ja normalisoitiin konstitutiivisesti ilmentyvän kromosomaalisen 16S rRNA-geenin runsauteen. Ekspressiotasot mitattiin myöhäisessä eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa kasvatetuista soluista. Kaikissa tapauksissa sekä ylävirran että alavirran ORF:ien geeniekspressioprofiilit olivat samankaltaisia villityyppi- ja mutanttikannoissa (kuva 4C). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset sulkevat pois sen mahdollisuuden, että hygromysiiniresistenssigeenin insertio aiheuttaisi polaarisia vaikutuksia.

M. smegmatis ΔrecA ja ΔrecA ΔrecX -mutanttikannat osoittavat heikentynyttä kasvua ja vähentynyttä solujen tuottoa suhteessa villityyppikantaan

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset sulkevat pois sen mahdollisuuden, että hygromysiiniresistenssigeenin insertio aiheuttaisi polaarisia vaikutuksia. smegmatis ΔrecX- ja ΔrecA ΔrecX-mutanttikantojen kuvaamiseksi mitattiin villityypin ja knockout-kantojen kasvuprofiilit 7H9 Middlebrook-liemessä 37 °C:ssa (kuva 5). recX-deletaatiolla ei ollut havaittavaa vaikutusta (verrattuna villityyppikantaan) M. smegmatis -bakteerin kasvuun. Vastaavissa olosuhteissa recA-deletrointi lisäsi selvästi lag-vaiheen pituutta ja lyhensi samanaikaisesti eksponentiaalista kasvuvaihetta, mikä viittaa siihen, että recA:lla on merkitystä M. smegmatis -bakteerin kasvussa ja elinkelpoisuudessa. Lisäksi nämä tulokset ovat yhdenmukaisia RecA:n tunnetun tehtävän kanssa pysähtyneiden tai romahtaneiden replikaatiohaarukoiden pelastamisessa71,72,73. Koska recA- ja recX-geenit muodostavat yhden operonin, tutkittiin niiden poiston vaikutusta M. smegmatiksen kasvuun. ΔrecA ΔrecX knockout -kannalla oli kasvufenotyyppi, joka oli ΔrecA-mutantin ja villityypin kannan välimuoto; kasvu myöhäisessä log- ja stationaarivaiheessa oli kuitenkin samanlaista kuin ΔrecA- ja villityypin kannoilla.

RecA:n, mutta ei recX:n, poistaminen tekee M. smegmatis -bakteerin alttiimmaksi DNA:ta vahingoittaville aineille

Mycobakteerien RecA-proteiinilla on muiden eubakteerien tapaan ratkaiseva rooli SOS-vasteen säätelyssä DNA-vaurion yhteydessä74,75,76,77. Sen testaamiseksi, vaikuttaako recArecX:n ja recX:n puuttuminen M. smegmatis -bakteerin kykyyn korjata tehokkaasti vaurioitunutta DNA:ta, mutantit altistettiin erilaisille aineille, joilla oli erilaiset DNA-vauriomekanismit. Näissä kokeissa stressi aiheutettiin altistamalla ΔrecA-, ΔrecX- ja ΔrecA ΔrecX-mutanttikannat UV-säteilylle, MMS:lle, H2O2:lle tai siprofloksasiinille bakteerikasvun eksponentiaalisen vaiheen aikana (OD600 0,6). Kolmen tunnin inkubaation jälkeen solut pestiin ja niiden elinkelpoisuus määritettiin tahrimalla kymmenkertaiset sarjalaimennokset viljelmistä Middlebrook 7H10 -agarlevyille, jotka sisälsivät hygromysiiniä (100 µg/ml). Sopivin DNA:ta vahingoittavien aineiden pitoisuus/annos määritettiin sen jälkeen, kun kantojen väliset erot solujen elinkelpoisuudessa arvioitiin levymäärityksillä. Ilman DNA:ta vahingoittavia aineita kaikkien kantojen solujen elinkyky oli samanlainen (kuva 6). Sitä vastoin DNA:ta vahingoittavien aineiden läsnä ollessa ΔrecA-kannassa ilmeni selvä kasvuhäiriö, johon liittyi 100-kertainen lasku levytystehokkuudessa verrattuna villityypin kantaan. Tämä fenotyyppi on yhdenmukainen saatavilla olevan kirjallisuuden kanssa. Sitä vastoin UV:n, MMS:n tai siprofloksasiinin, mutta ei H2O2:n, tappava vaikutus estettiin osittain poistamalla recX-geeni ΔrecA-kannasta. Vaikka H2O2:n vaikutuksen puuttumisen perusta ei ole selvä, käytetty pitoisuus ei todennäköisesti ollut riittävän suuri vaikuttamaan kasvuun. Mielenkiintoista on, että ΔrecX-kannalla oli hieman vastustuskykyisempi fenotyyppi kaikkia neljää DNA:ta vahingoittavaa ainetta vastaan kuin ΔrecA ΔrecX-kannalla, mikä viittaa mahdolliseen recX-geenin menettämisestä johtuvaan toimintakyvyn lisääntymiseen. Näiden tulosten perusteella on ilmeistä, että recA:lla on aktiivinen rooli SOS-vasteessa ja että herkkyys DNA:ta vahingoittaville aineille on hieman heikentynyt ΔrecX-kannassa.

Selviytyminen DNA:ta vahingoittavien aineiden eri pitoisuuksilla tehdyn käsittelyn jälkeen

Mykobakteerit kokevat useita epäsuotuisia stressitilanteita, kuten oksidatiivista, ravitsemuksellista ja lääkkeiden aiheuttamaa stressiä78,79,80,81,82. Solujen elinkelpoisuuserojen tutkimiseksi tarkemmin tehtiin kokeita, joissa solujen elinkelpoisuutta mitattiin pesäkkeiden muodostusyksiköillä (CFU). Ensin testattiin M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX ja ΔrecAΔrecX -mutaatioiden elinkelpoisuutta verrattuna villityypin elinkelpoisuuteen haastamalla ne kasvavilla MMS-pitoisuuksilla. Kantoja kasvatettiin ilmoitettujen MMS-pitoisuuksien läsnäollessa, kunnes viljelmien OD600 oli 0,6. Solujen elinkelpoisuus määritettiin asettamalla ennalta määrätty määrä soluja 7H10-agarlevyille. Soluja pidettiin elävinä, jos ne pystyivät jakautumaan ja muodostamaan pesäkkeitä. Mutantit, toisin kuin villityyppikanta, osoittivat lisääntynyttä herkkyyttä MMS:lle pitoisuusriippuvaisesti. Kvantitatiivinen analyysi osoitti, että ΔrecA-mutantilla oli suhteellisesti suurempi herkkyys MMS:lle, joka lisääntyi MMS:n pitoisuuden kasvaessa (kuva 7A). ΔrecX:n tapauksessa solut olivat ~2-kertaisesti vähemmän herkkiä MMS:lle verrattuna ΔrecA-soluihin. Toisaalta ΔrecA ΔrecX-mutantti osoitti suurempaa herkkyyttä MMS:lle toisin kuin ΔrecX-mutantti. ΔrecX-mutantin herkkyys MMS:lle osoittaa, että recX:llä voi olla RecA:n lisäksi vielä tunnistamattomia kohteita. Tämä oletus vaatii lisätutkimuksia.

Seuraavaksi tarkasteltiin herkkyyttä M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX ja ΔrecA ΔrecX mutanttikannat suhteessa villityypin kantaan määritettiin altistamalla ne kasvaville H2O2-pitoisuuksille. Tulokset osoittavat, että ΔrecA-mutantti oli vähemmän herkkä tälle käsittelylle (kuva 7B). Pelkällä recX:n poistolla tai recA-recX-lokuksen poistolla oli vain vähäinen vaikutus mutanttisolujen elinkelpoisuuteen ja lisääntymiseen H2O2-käsittelyn vaikutuksesta. Huomionarvoista on, että ΔrecA- ja ΔrecAΔrecX-mutanttikannoilla oli UV-säteilyn ja siprofloksasiinin vaikutuksesta herkkä kasvufenotyyppi, joka on huomattavasti paljon voimakkaampi kuin MMS:n tai H2O2:n vaikutuksesta (kuvat 7C,D). Lisäksi ΔrecA-kanta osoitti suurempaa herkkyyttä UV-säteilylle ja siprofloksasiinille kuin ΔrecA ΔrecX-kaksoismutanttikanta.

RecA- ja recX-geenien ilmentyminen indusoituu DNA-vaurion vaikutuksesta

RecA-geenin yläjuoksulla olevat säätelyelementit eivät ole konservoituneita kaikissa mykobakteerilajeissa. Esimerkiksi M. tuberculosis recA -geeni transkriboituu kahdesta promoottorista: molemmat ovat DNA-vaurion indusoimia, vaikkakin eri mekanismeilla. M. tuberculosis recA:n promoottori P1 (lähimpänä aloituskodonia) voi indusoitua DNA-vaurion jälkeen LexA- ja RecA-proteiineista riippumatta. Sitä vastoin promoottoria P2 (joka sijaitsee kauempana recA:n aloituskodonista) säätelee LexA, joka on toiminnallisesti analoginen E. coli recA-promoottorin kanssa83,84,85. Mielenkiintoista on, että M. tuberculosis -bakteerin DNA-vaurion induktiomekanismi ei ole täysin konservoitunut M. smegmatis -bakteerissa46,75. Nämä havainnot korostavat tarvetta ymmärtää M. smegmatis -bakteerin recA- ja recX-geenien ilmentymistä ja säätelyä sekä niiden roolia vasteena DNA:ta vahingoittaville aineille.

Kuten edellä on kuvattu, hypoksia aiheutti M. smegmatis -bakteerin recA- ja recX-geenien ilmentymisen lisääntymistä (kuva 1). Sen käsityksen vahvistamiseksi, että M. smegmatis recA- ja recX-geenien ilmentyminen on vaurio-indusoituvaa, määritettiin induktion kinetiikka DNA-vaurion kanssa ja ilman sitä RT-qPCR:n avulla. RNA:n kokonaisnäytteet valmistettiin M. smegmatis -soluista, jotka kerättiin 0, 3, 6, 9 ja 12 tuntia UV-valolle altistumisen jälkeen, sekä käsittelemättömistä viljelmistä, ja ne analysoitiin menetelmiä käsittelevässä osassa kuvatulla tavalla. Tulokset eivät osoittaneet merkittäviä eroja recA- ja recX-transkriptiotasojen välillä käsittelemättömissä soluissa. Sitä vastoin recA:n ja recX:n mRNA-transkriptien huomattavaa kasvua havaittiin 3 tuntia UV-säteilylle altistumisen jälkeen, minkä jälkeen ne vähenivät hieman. RT-qPCR-tietojen vertailu osoittaa merkittäviä eroja recA:n ja recX:n transkriptiotasojen välillä. UV-säteilylle altistuminen johti recA:n mRNA:n ~8-kertaiseen lisääntymiseen kontrolliin verrattuna, kun taas recX:n ~3-kertaiseen lisääntymiseen (Kuva 8A,B). Näin ollen, vaikka recA- ja recX-mRNA esiintyvät samassa transkriptioyksikössä, nämä tulokset tukevat ajatusta siitä, että recX-mRNA-transkriptin tuotantoon ja/tai stabiilisuuteen liittyy ylimääräinen posttranskriptiivinen säätelymekanismi.

Nämä tulokset saivat meidät suorittamaan lisäkokeita määrittääksemme RecA:n ja RecX:n valkuaisaineiden kertymisen kinetiikan M. smegmatis -soluissa, joissa on DNA-vaurio tai joissa sitä ei ole. Western blotting -määritykset tehtiin kokosolulysaateista käyttäen RecA:ta ja RecX:ää vastaan kasvatettuja polyklonaalisia vasta-aineita (kuva 8C). Western-blottien kvantifiointi osoitti, että solut sisälsivät merkittäviä määriä sekä RecA- että RecX-proteiineja indusoimattomissa soluissa (Kuva 8D,E). Vertailun vuoksi voidaan todeta, että sekä RecA:n että RecX:n runsaus kasvoi 2-kertaiseksi (kontrolliin verrattuna) soluissa 3 tuntia UV-säteilylle altistumisen jälkeen ja väheni sen jälkeen. Tärkeää on, että RecA- ja RecX-proteiinien induktio muistutti mallia, joka havaittiin soluissa hypoksisissa olosuhteissa (kuva 2), vaikka mekanismit, joilla ne vaurioittavat DNA:ta, ovat todennäköisesti erilaiset.

Loppuhuomautukset

Lukuiset tutkimukset ovat osoittaneet, että recA ja recX suorittavat monenlaisia DNA:n korjaukseen ja rekombinaatioon liittyviä toimintoja7,10. Tietojemme mukaan M. smegmatis -bakteerin recA- ja recX-geenien ilmentymistä aktivoivia ärsykkeitä ei ole tunnistettu. Tässä tutkimuksessa näiden geenien ilmentymistasoja arvioitiin soluissa aerobisessa kasvussa ja vasteena erilaisiin stressiolosuhteisiin. M. smegmatis -bakteerissa, kuten monissa bakteerilajeissa, recA- ja recX-geenit kuuluvat samaan operoniin, ja recX-geeni sijaitsee välittömästi recA-geenin alapuolella, ja niillä on päällekkäiset koodausalueet86. Havaittiin, että DNA:ta vahingoittavat aineet indusoivat molempien geenien ilmentymistä eri laajuisesti; ilmentymissuhteet noudattavat kuitenkin samanlaista kaavaa. Mielenkiintoista on, että sekä RecA:n että RecX:n tasot pysyvät korkeina stressiolosuhteissa verrattuna aerobisiin kasvuolosuhteisiin.

Monissa tutkimuksissa on osoitettu, että recX:llä on vaihtoehtoisia rooleja RecA:n edistämässä rekombinaationaalisessa DNA:n korjauksessa. Vaikka RecX-proteiini on fyysisesti vuorovaikutuksessa RecA:n kanssa ja toimii voimakkaana inhibiittorina jälkimmäisen kaikille tunnetuille toiminnoille monissa bakteerilajeissa14,46,48, se tehostaa homologista rekombinaatiota N. gonorrhoeae- ja B. subtilis -bakteereissa25,26. Jotta saataisiin käsitys recX:n roolista stressivasteessa mykobakteereissa, rakennettiin M. smegmatis -bakteerin recX:n ja recArecX:n knockout-mutantteja. Mielenkiintoista oli, että recX:n poistaminen M. smegmatis -bakteerista johti hieman vastustuskykyisempään fenotyyppiin kaikkia neljää DNA:ta vahingoittavaa ainetta vastaan, mikä osoittaa, että recX-geenin menettäminen mahdollisesti lisää toimintakykyä. Tämän vaikutuksen molekulaarinen perusta ei ole selvä, ja sitä kannattaa tutkia tulevissa tutkimuksissa. Vaikka analyysimme keskittyi pääasiassa recA:n ja recX:n väliseen geneettiseen vuorovaikutukseen rekombinaationaalisessa DNA:n korjausreitissä, mielenkiintoista on, että recX:llä näyttää olevan tärkeä rooli bakteerien kasvussa. Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä havainnot ovat sopusoinnussa sen ajatuksen kanssa, että M. smegmatis recX:llä on tärkeä rooli DNA:n korjaus-/rekombinaatioprosesseissa epäsuotuisissa olosuhteissa, ehkä säätelemällä vielä tuntemattomien geenien osajoukon haitallisia vaikutuksia.

Käytetyt lyhenteet ovat

DTT, ditiotreitoli; EDTA, etyleenidiamiinitetraetikkahappo; kb, kilobaasi; MMS, metyylimetaanisulfonaatti; ODN, oligonukleotidi; PAGE, polyakryyliamidigeelielektroforeesi; PVDF, polyvinylideenidifluoridikalvo; RT-qPCR, käänteinen transkriptio, kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio; SDS, natriumdodekyylisulfaatti; ssDNA, yksijuosteinen DNA; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M natriumsitraattipuskuri (pH 7,0).