Virus ja solut
Ellei toisin mainita, kaikki kokeet tehtiin käyttäen kliinistä influenssaviruksen isolaattia MDCK-soluissa A/Memphis/14/96-M (H1N1), jonka ystävällisesti toimitti tohtori Robert Webster (St. Juden lastensairaala, USA) . Kuvassa 5 kuvatut virukset saimme ystävällisesti kiitoksissa luetelluilta kollegoilta.
MDCK-solut ja MDCK-SIAT1-solut, jotka on stabiilisti transfektoitu 2,6-sialyylitransferaasilla Neu5Ac2-6Gal-päätteisten oligosakkaridien tehostettua ilmentymistä varten, on kuvattu aiemmin . Lisäsimme molempia solutyyppejä DMEM:ssä (Gibco), jota täydennettiin 2 mM L-glutamiinilla, 10 %:lla vasikan sikiöseerumilla ja antibiooteilla (streptomysiini, 100 mg/ml ja penisilliini, 100 U/ml).
Ylläpitoväliaine
Virusinfektion nestemäisenä ylläpitoväliaineena (MM) käytimme Eaglen MEM:ää, joka sisälsi L-glutamiinia, 0,1 % BSA:ta (Sigma, A-0336), antibiootteja ja 1 μg/ml TPCK-tripsiiniä (Sigma, T-1426).
Kannat 1,8 % Bacto-Agarista (BD, 214010) ja 2 % metyyliselluloosasta (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s 2 %:ssa, Fluka) tislatussa vedessä valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla .
Avicel RC/CL:n valmistaja (FMC BioPolymer) toimitti ystävällisesti kolmea erityyppistä Avicelia (RC-581, RC-591 ja CL-661) testausta varten. Valmistimme Avicelin kantasuspensioita dispergoimalla 2,4 g Avicel-jauhetta 100 ml:aan tislattua vettä tavallisella magneettisekoittimella 1 tunnin ajan. Agar-, MC- ja Avicel-kannat steriloitiin autoklavoimalla 20 minuutin ajan 121 °C:ssa ja varastoitiin huoneenlämmössä.
Päällysteet valmistettiin sekoittamalla MC:n, Avicelin tai sulatetun agarin kantaliuokset yhtä suuriin tilavuuksiin kaksinkertaisen vahvuista ylläpitoalustaa. MC:n ja Avicelin pitoisuuksien vaihtelemiseksi päällysteissä laimennettiin alkuperäiset kantaliuokset steriilillä vedellä. Agar-päällyste valmistettiin 42-44 °C:ssa, kaksi muuta päällystettä valmistettiin joko 20 tai 37 °C:ssa.
Konsentroidut (2,4 %) Avicel-kannat eivät tyypillisesti eronneet toisistaan varastoinnin aikana, laimennetut Avicel-pohjaiset päällysteet eivät kuitenkaan olleet yhtä vakaita. Jos katsottiin tarpeelliseksi, sekoitimme Avicel-kantoja ja sekoitimme Avicel-päällysteet aina ennen käyttöä joko ravistamalla käsin tai vortexaamalla. Päällysteiden hidas erottuminen sen jälkeen, kun niitä oli levitetty solumonolayereihin, ei vaikuttanut määritystuloksiin.
Plakkimääritys 6-kuoppalevyillä
Tunti sen jälkeen, kun olimme infektoineet solumonolayerit 30-50 plakkia muodostavalla yksiköllä virusta 1 ml:ssa ylläpitävää elatusainetta, jossa ei ollut mukana trypsiiniä, poistimme viruksen inokulumin, päällystimme solut kolmella millilitralla eri päällystyselatusaineita ja inkuboimme viljelmiä 35 C:ssa 5 %:n hiilidioksiditason ilmakehässä. MC- ja Avicel-päällysteiden tapauksessa huolehdittiin siitä, että levyjä ei häiritty inkubointiaikana, jotta vältettäisiin epätasaisten plakkien muodostuminen. Kolmen päivän inkubaation jälkeen päällysteet poistettiin ja solut kiinnitettiin. Agar-päällyste poistettiin metallilastalla; MC-, Avicel- ja nestepäällysteet poistettiin imulla. Solut kiinnitettiin 4 %:n paraformaldehydiliuoksella MEM:ssä 30 minuutin ajan 4 °C:ssa ja pestiin PBS:llä. Kaikki solujen myöhemmät käsittelyt tehtiin huoneenlämmössä. Permeabiloimme solut ja estimme samanaikaisesti jäljellä olevat aldehydiryhmät inkuboimalla soluja 10-20 minuutin ajan 1 ml/kuoppa liuoksella, joka sisälsi 0,5 % Triton-X-100:a ja 20 mM glysiiniä PBS:ssä. Immuunivärjäsimme viruksen infektoimat solut inkuboimalla 1 tunnin ajan influenssa A -viruksen nukleoproteiinille spesifisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla (ystävällisesti toimitti tohtori Alexander Klimov Centers for Disease Control -laitokselta, USA), minkä jälkeen inkuboimme 1 tunnin ajan peroksidaasilla leimatuilla hiiren vasta-aineilla (DAKO, Tanska) ja inkuboimme 30 minuutin ajan sakkaa muodostavilla peroksidaasisubstraateilla. Immunovasta-aineiden työlaimennosten valmistukseen käytettiin liuosta, jossa oli 10 % normaalia hevosseerumia ja 0,05 % Tween-80:tä PBS:ssä. Pesimme solut primaari- ja sekundäärivasta-aineiden jälkeen inkuboimalla niitä kolme kertaa 3-5 minuutin ajan 0,05 % Tween-80:llä PBS:ssä. Peroksidaasisubstraatteina käytimme joko käyttövalmista True Blue™ -liuosta (KPL) tai aminoetyylikarbatsoliliuosta (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml), joka oli valmistettu 0,05 M natriumasetaattipuskuriin, pH 5,5, ja joka sisälsi 0,03 % H2O2:ta. Värjätyt levyt pestiin vesijohtovedellä reaktion pysäyttämiseksi ja kuivattiin. True Blue -värjäyksen tapauksessa, joka on suhteellisen epävakaa vesiliuoksissa, levyt kuivattiin ylösalaisin valkaisun minimoimiseksi. Värjätyt levyt skannattiin tasoskannerilla ja tiedot otettiin Adobe Photoshop 7.0 -ohjelmistolla.
Vaihtoehtona immunovärjäykselle paljastimme joissakin kokeissa plakit tuhoutuneiden solujen alueina. Tätä varten värjäsimme solut päällyslevyjen poistamisen jälkeen 1-prosenttisella kristalliviolettiliuoksella, joka oli 20-prosenttisessa metanolissa vedessä.
Variaatiot viruksen titrauksesta 96-kuoppalevyissä
1. Standardivariantti
Infektoimme MDCK- tai MDCK-SIAT1-solumonolyyrejä 96-kuoppalevyillä 50 μl/kuoppa viruksen sarjalaimennoksilla ylläpitoväliaineessa ilman trypsiiniä. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 35 °C:ssa 5 % CO2:ssa poistimme viruksen, lisäsimme 100 μl/kuoppa joko MC- tai Avicel-päällystysmediaa ja inkuboimme soluja vielä 24 tuntia plakkien muodostumisen mahdollistamiseksi. Fiksaatio ja immunovärjäys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla 6 kuoppalevyille, mutta käyttäen 50 μl reagensseja kuoppaa kohti.
2. Yksinkertaistettu muunnos
Koe suoritettiin täsmälleen kuten standardivaihtoehdossa seuraavin muutoksin. Kun virusta oli inkuboitu 1 h, inokulaatiota ei poistettu. Lisäsimme 100 μl/kuoppa Avicel overlay -mediaa ja sekoitimme levyn joko naputtelemalla käsin tai käyttämällä levysekoitinta. Väliaine sisälsi suurennetun määrän trypsiiniä (1,5 μg/ml) kompensoidaksemme peittausaineen laimentumista kuopissa olleella virusta sisältävällä materiaalilla.
Plakki-inhibiittorimääritys
Noel Roberts (Roche Products, Iso-Britannia) toimitti ystävällisesti neuraminidaasin estäjän oseltamiviirikarboksylaatin (OC). Lisäsimme 50 μl/kuoppa OC:n 10-kertaisia sarjalaimennoksia ylläpitoväliaineessa ilman trypsiiniä (konsentraatioväli 4 nM:stä 400 μM:iin OC:tä) 96-kuoppalevyillä oleviin MDCK-SIAT1-solujen monokerroksiin. Tämän jälkeen lisättiin 50 μl/kuoppa viruslaimennoksia (20-40 plakkia muodostavaa yksikköä kuoppaa kohti). Sekoitimme levyn ja inkuboimme sitä 1 tunnin ajan 35 °C:ssa, jotta virusinfektio käynnistyisi. Tämän jälkeen lisäsimme 100 μl/kuoppa 1,2 % Avicel-päällysteistä mediaa, joka sisälsi 2 μg/ml trypsiiniä, inkuboimme viljelmiä 24 h ja fiksoimme ja immunovärjäsimme ne edellä kuvatulla tavalla.
Kuusi kuoppalevyjen tapauksessa lisäsimme 0,75 ml:n alikvootteja lääkeaineesta ja inhibiittorista sekä 1,5 ml:n alikvoottia Avicelia kuoppaa kohden ja immunovärjäsimme plakit 3 päivän kuluttua infektiosta.