Practice for Human Genetics Wien

Genomin laajuinen mikroaberraatioiden etsintä: Array-CGH

Kromosomimateriaalin moninkertaistumiseen tai vähenemiseen perustuvat monimutkaiset oireyhtymät on tunnettu jo pitkään. Esimerkiksi trisomia 21:ssä kokonainen kromosomi on kolme kertaa eikä kaksi kertaa. Mikrodeleetio-oireyhtymissä, kuten Williams-Beurenin, Prader-Willin tai Smith-Magenisin oireyhtymässä, kromosomista puuttuu enemmän tai vähemmän määriteltyjä kromosomin osia, jotka ovat yleensä submikroskooppisen pieniä, muutaman megatavun kokoisia. Monogeneettisissä sairauksissa yksittäisten geenien tai geenisegmenttien deleetioita tai duplikaatioita on viime aikoina löydetty yhä useammin sairauden aiheuttajina.

Tällaisten geenien annosmuutosten diagnosoimiseen tähän mennessä käytetyillä tekniikoilla on rajoituksensa: Vaikka esimerkiksi molekyylisytogeneettisiä menetelmiä, kuten FISH-menetelmää, tai molekyyligeneettisiä menetelmiä, kuten MLPA-menetelmää, voidaan käyttää korkealla tai korkeimmalla resoluutiolla, niiden on tiedettävä tai oletettava etukäteen, mikä genomin alue on kyseessä. Toisaalta klassinen sytogenetiikka tai CGH-tekniikka (”vertaileva genomihybridisaatio”: Potilas- ja referenssi-DNA:n vertaileva hybridisaatio metafaasikromosomeilla) voi kattaa koko genomin, mutta resoluutio rajoittuu parhaimmillaan noin 5 Mb:iin valomikroskoopin käytön vuoksi.

Tämän nykyisten tekniikoiden rajoitusten poistamiseksi array-CGH on sopiva vaihtoehto.

Tässä yhdistetään perinteinen CGH-tekniikka ja ekspressioanalyyseistä saadut kokemukset, jotka on saatu käyttämällä mikrosarjoja: Hybridisaatiokohteina toimivat lasilevyn pinnalle immobilisoidut määritellyt DNA-fragmentit, ja termi ”array” viittaa näiden fragmenttien säännölliseen, ruudukkomaiseen sijoitteluun. Fragmentit valitaan siten, että ne kattavat ihmisen genomin mahdollisimman tasaisesti.

Analyysia varten potilaan DNA:ta ja referenssigenomista DNA:ta kohybridisoidaan matriisiin suunnilleen yhtä suuria määriä. Koska potilas- ja referenssi-DNA-näytteet on merkitty erilaisilla fluoresoivilla väriaineilla, potilaan genomissa tapahtuva numeerinen muutos johtaa yksittäisten fragmenttien fluoresenssisignaalin värisiirtymään hybridisoitumissuhteen siirtymän kautta.

Skeemaattinen esitys array CGH -tekniikasta:

skanneri havaitsee fluoresenssisignaalin ja rekisteröi värinsiirtymät. Asianmukaisen ohjelmiston avulla signaalit osoitetaan geenialueelle, ja lopuksi tulos voidaan esittää esimerkiksi ”karyogrammina”, josta näkyy, missä kromosomin kohdassa muutoksia esiintyy.

Näyttö array-CGH:n tuloksesta: alueen Xp11-p21.1 duplikaatio (luotu ZMG:ssä CGHAnalytics-ohjelmalla, Agilent)

Fragmenttien määrä ja tiheys array:ssä määrittävät array-CGH:n resoluution. Tällä hetkellä saatavilla on matriiseja, jotka kattavat koko ihmisen genomin ja joiden resoluutio vaihtelee 1 Mb:stä noin 35 kb:iin. Koska fragmenttien määrä arraya kohti kasvaa jatkuvasti, resoluutio kasvaa edelleen. Näin yksittäisten geenien epätasapainot voidaan havaita luotettavasti.

CGH-joukkojen sovellukset

CGH-joukkojen avulla voidaan siis seuloa potilaan koko genomi suurella resoluutiolla poikkeamien löytämiseksi normaalista geenien annostuksesta. Sen merkitys innovatiivisena seulontamenetelmänä on kasvamassa, vaikka sitä käytettiinkin aluksi pääasiassa kasvaindiagnostiikassa. Tämä johtuu siitä, että kasvaimen etenemiselle on ominaista poikkeavuuksien kasaantuminen, johon voi liittyä onkogeenien monistuminen ja kasvainsuppressorigeenien deletoituminen.

ArrayCGH on erityisen kiinnostava selittämättömän älyllisen jälkeenjääneisyyden diagnosoinnissa. Tavanomaisessa sytogenetiikassa poikkeavuudet näkyvät noin 5 prosentissa tapauksista potilailla, joilla on älyllinen jälkeenjääneisyys ja muita merkkejä dysmorfiasta tai familiaalisesta klusteroitumisesta. Subtelomeerien seulonta FISH:llä tai MLPA:lla voi löytää syyn vielä 5 prosentissa tapauksista. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että noin 1 Mb:n resoluution omaava array CGH paljastaa genomisen epätasapainon 10-15 prosentilla potilaista, joiden karyotyyppi on epäselvä ja subtelomeerilöydökset negatiivisia. (ks. kirjallisuus). Oletuksena on, että tämä havaitsemisnopeus kasvaa, kun matriisien resoluutio kasvaa. Jotkin tutkimusryhmät suosittelevat jo array CH:tä ensimmäiseksi diagnostiseksi vaiheeksi selittämättömän älyllisen jälkeenjääneisyyden tapauksissa.

Sen lisäksi, että array CH:llä voidaan havaita uusia epätasapainotyyppejä, sen avulla voidaan myös määrittää tarkasti deletion koko, murtumakohtien sijainti tai lisämateriaalin alkuperä tapauksissa, joissa on sytogeneettisesti havaittavissa kromosomialueiden häviäminen tai lisääntyminen. Tämä on tärkeää genotyypin ja fenotyypin tarkan korrelaation kannalta ja MR:n ja dysmorfian kehittymiseen vaikuttavien geeniehdokkaiden tunnistamiseksi. Joissakin kromosomipoikkeavuuksissa, jotka on aiemmin todettu ”tasapainoisiksi” translokaatioiksi, array CGH on osoittanut, että geneettistä materiaalia on deletoitunut tai duplikoitunut katkaisupisteiden alueella ja että kyseessä on siten epätasapainoinen translokaatio. Siten array CGH:n avulla sytogeneettiset löydökset tarkentuvat ja korjaantuvat.

Vaikka sytogenetiikan ja molekyyligenetiikan rajat hämärtyvät yhä enemmän, karyotyypin määritys on edelleen tärkeää, koska tietyt kromosomimuutokset eivät ole havaittavissa array CGH:lla: Polyploidiat, todelliset tasapainoiset translokaatiot ja mosaiikkitilat, joissa on vain pieni osa poikkeavia soluja.

Koska CGH:n korkea havaitsemisnopeus kattaa koko genomin ja koska aikaa ja työvoimaa vaativaa soluviljelyä ei tarvita, se avaa uusia mahdollisuuksia synnytystä edeltävään diagnostiikkaan.

Kaikkien näiden uraauurtavien tekniikoiden tuomien etujen ja mahdollisuuksien lisäksi ei pidä kuitenkaan unohtaa sitä, että tässä vaiheessa harppaus tutkimuksesta diagnostiikkaan on vasta tapahtumassa. Näin ollen array CGH ei ainoastaan selvitä avoimia kysymyksiä, vaan tulosten tulkinta voi myös herättää uusia kysymyksiä:

Array CGH -tutkimusten avulla on havaittu, että ihmisen genomissa on odottamattoman paljon alueita, joiden kopioluku vaihtelee fenotyyppisesti normaaleilla ihmisillä (ks. kirjallisuus). Näiden CNV:iden (”copy number variations”) koko vaihtelee muutamasta kilobasista useisiin megatavuihin. On arvioitu, että jokaisella yksilöllä on vähintään 3-11 tällaista variaatiota. Tietokantoja, joissa luetellaan tällaisia polymorfismeja (eli mutaatioita, jotka eivät ilmeisesti vaikuta fenotyyppiin), ollaan vasta luomassa, joten ne ovat vielä epätäydellisiä. Jos potilaan DNA:sta nyt löydetään poikkeavuuksia array CGH:lla, on usein spekulatiivista, ovatko nämä ylipäätään vastuussa fenotyypistä. Useimmissa tapauksissa on tarpeen tutkia myös vanhempien DNA.

Todennäköisyys, että kromosomipoikkeavuus on sairautta aiheuttava, kasvaa

• poikkeavuuden koon kasvaessa
• jos se esiintyy ”de novo”, vanhemmat eivät kanna tätä poikkeamaa
• jos sitä ei ole lueteltu missään polymorfismitietokannassa
• jos vaikuttaa geeneihin, jotka voidaan liittää havaittuun fenotyyppiin
• jos tiedetään, että tapaukset, joilla on sama tai samankaltainen poikkeama, osoittavat samankaltaista fenotyyppiä.

Mitä enemmän array CGH:ta käytetään kliinisessä diagnostiikassa, sitä todennäköisemmin array-suunnittelu mukautuu alan vaatimuksiin: Välttämällä tunnettuja CNV-alueita ja suosimalla kromosomialueita ja geenejä, joilla on osuutta älylliseen jälkeenjääneisyyteen ja dysmorfisiin oireyhtymiin, matriiseista tulee yhä kiinnostavampia synnytystä edeltävässä ja postnataalisessa diagnostiikassa.

Instituuttimme on ottanut kurssin, jonka avulla voimme hyödyntää matriisiteknologiaa jo nyt ja pystyä tarttumaan tulevaan kehitykseen välittömästi. Olemme valinneet teknisen laitteiston, joka pystyy arvioimaan matriiseja myös korkeimmalla resoluutiolla luotettavasti ja toistettavasti.

Ota meihin yhteyttä, jos haluat käyttää palveluitamme ja kokemustamme array CGH:n alalla. Kerromme mielellämme tällaisen tutkimuksen kestosta, kustannuksista ja tällä hetkellä käytettävissä olevista array-malleista.

viitteet

Array CGH in mental retardation

Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP. Mikrosirupohjaisella vertailevalla genomihybridisaatiolla (array-CGH) havaitaan submikroskooppisia kromosomideleetioita ja -duplikaatioita potilailla, joilla on oppimisvaikeuksia/ henkistä jälkeenjääneisyyttä ja dysmorfisia piirteitä. J Med Genet. 2004 Apr;41(4):241-8.

de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA. Diagnostinen genomiprofilointi kehitysvammaisuudessa. Am J Hum Genet. 2005 Oct;77(4):606-16.

Menten B, Maas N, Thienpont B, Buysse K, Vandesompele J, Melotte C, de Ravel T, Van Vooren S, Balikova I, Backx L, Janssens S, De Paepe A, De Moor B, Moreau Y, Marynen P, Fryns JP, Mortier G, Devriendt K, Speleman F, Vermeesch JR. Kryptisten kromosomipoikkeavuuksien ilmenemismallit potilailla, joilla on idiopaattinen kehitysvammaisuus ja useita synnynnäisiä poikkeavuuksia: uusi 140 potilaan sarja ja kirjallisuuskatsaus. J Med Genet. 2006.

Array-CGH in der Pränataldiagnostik

Rickman L, Fiegler H, Shaw-Smith C, Nash R, Cirigliano V, Voglino G, Ng BL, Scott C, Whittaker J, Adinolfi M, Carter NP, Bobrow M. Prenataalinen epätasapainossa olevien kromosomirelaatioiden havaitseminen kromosomitason uudelleenjärjestäytymisten tunnistamismenetelmällä (Array-CGH). J Med Genet. 2006 Apr;43(4):353-61.

Van den Veyver, IB; Beaudet AL. Vertaileva genomihybridisaatio ja prenataalinen diagnostiikka. Curr Opin Obstet Gynecol 2006 (18): 185-191.

Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Rakenteellinen vaihtelu ihmisen genomissa. Nat Rev Genet. 2006 Feb;7(2):85-97