Yllätyslöytö uudesta Notch-signalointiproteiinin hallitsemasta reitistä avaa ovia paremmalle lääkekehitykselle
Toimittaja Lindsay Brownell
(BOSTON) – Joka minuutti puolentoista litran veri pulssittaa elimistön suoni- ja valtimoverkoston läpi. Tuon verenkierron voima auttaa pitämään verisuonia reunustavat solut, joita kutsutaan endoteelisoluiksi, terveinä; kun verenkierto häiriintyy, kuten kirurgisten toimenpiteiden tai aivohalvauksen aikana, verisuonet alkavat vuotaa, mikä voi aiheuttaa lukuisia tulehdusreaktioita, jotka johtavat soluvaurioihin ja sairauksiin. Harvardin yliopiston Wyss-instituutin tutkijat ryhtyivät selvittämään mysteeriä siitä, miten verenkierto pitää verisuonet ehjinä, ja löysivät yllätyksekseen täysin uuden solusignaalireitin, joka on lupaava kohde lääkkeille, joilla voidaan hoitaa monia heikentäviä sairauksia.
”Havaitsimme, että tunnettu Notch-proteiini on vastuussa siitä, että verisuonet eivät vuoda, ja se tekee sen toissijaisen signaalireitin kautta, joka toimii täysin eri tavalla kuin sen tunnettu transkriptioon perustuva reitti”, sanoo Wyss-instituutin apulaisprofessori Chris Chen, Wyss-instituutin tiedekunnan apulaisjäsen, biologisen suunnittelukeskuksen perustajajohtaja ja Bostonin yliopiston biolääketieteellisen insinööritieteiden professori (Distinguished Professor of Biomedical Engineering, Bostonin yliopisto, ), ja hän on artikkelin vastaava tekijä. ”Tämä uusi reitti ei ole jännittävä vain löytämisen kannalta, vaan se voi myös parantaa joitakin syöpä- ja sydän- ja verisuonilääkkeiden sivuvaikutuksia ja tehdä niistä turvallisempia ja tehokkaampia.” Tutkimus julkaistaan tänään Nature-lehdessä.
Verisuonia reunustavat endoteelisolut liittyvät tiukasti toisiinsa adherens-liitoksiksi kutsuttujen yhteyksien kautta muodostaen esteen, joka pitää veren verisuonen sisällä ja säätelee sitä, kuinka helposti muut aineet pääsevät kulkemaan verisuonen sisään ja ulos. Tutkiakseen tätä estettä ja selvittääkseen, miksi verenkierron puute saa sen vuotamaan, tutkijat rakensivat verisuoni-on-a-chip-mallin, joka koostui ihmisen endoteelisoluilla vuoratusta kanavasta, jota ympäröi solunulkoinen matriisi mikrofluidisessa laitteessa. Näin he pystyivät helposti simuloimaan ja kontrolloimaan veren virtausta verisuonessa ja arvioimaan solujen reaktioita.
Verenkierron kokeneiden endoteelisolujen aktiivisuus lisääntyi transmembraaniproteiinina toimivan Notch1:n aktiivisuudelta, kun taas staattiselle verenkierrolle altistuneilla soluilla ei. Kun tutkijat lisäsivät kemikaalia, joka estää Notch1:n aktivoitumisen estämällä sen solunsisäisen domeenin irtoamisen, he havaitsivat, että verisuoni alkoi vuotaa, minkä he päättelivät johtuvan viereisten endoteelisolujen välisten adherens-liitosten katkeamisesta ja aktiinisäikeiden uudelleenjärjestäytymisestä kunkin solun sisällä. Tämä vahvisti, että Notch1:n aktivoituminen verenkierron vaikutuksesta on välttämätöntä verisuonten endoteeliesteen muodostumiselle ja ylläpitämiselle.
Yllättävää oli, että Notch1:n solunsisäisen domeenin estäminen käynnistämästä transkriptiota irtoamisen jälkeen (mikä on Notch1:n vakiintunut toimintamekanismi) ei saanut verisuonta vuotamaan, mikä viittasi siihen, että verenkierron vaikutuksesta reagoi jokin muu osa proteiinista, jonka tehtävään transkriptiota ei kuulunut. Tätä epäilyä vahvistivat in vivo -kokeet, joissa tutkijat ruiskuttivat hiirille kemikaalia, joka esti Notch1:n toiminnan yhdessä sinisen väriaineen kanssa, ja havaitsivat, että väriaine vuoti hoidettujen hiirten verisuonista paljon odotettua nopeammin. ”Geenin transkriptio proteiiniksi, joka sitten suorittaa jonkin toiminnon solussa, kestää yleensä noin kaksi tuntia, mutta me näimme vuotoa 30 minuutissa, mikä viittaa siihen, että esteen läpäisevyyttä säätelevä prosessi toimii täysin erilaisella mekanismilla”, sanoo tohtori Bill Polacheck, Wyss-instituutin tohtorikoulutettava ja artikkelin ensimmäinen kirjoittaja.
Kun he olivat todenneet, että solunsisäinen domeeni ei osallistunut endoteelin esteen säätelyyn, tutkijat tutkivat Notch1:n muita osia aktiivisuuden varalta. He käyttivät CRISPR/Cas-9:ää Notch1-geenin eri osien poistamiseen ja havaitsivat, että solunsisäistä domeenia koodaavan osan poistamisella ei ollut vaikutusta läpäisevyyteen, kun taas pienen transmembraanidomeenia (TMD) koodaavan osan poistaminen aiheutti verisuonten vuodon lisääntymisen virtausolosuhteissa. ”Tämä on ensimmäinen kerta, kun Notchin TMD:n biologista toimintaa on koskaan arvioitu”, sanoo tohtori Matthew Kutys, Wyss-instituutin vieraileva tutkija ja ensimmäinen kirjoittaja. ”Sen oletettiin pitkälti olevan inertti ja vain tavallaan katoavan aktivoinnin jälkeen, ja useimmissa oppikirjoissa ja tutkimusjulkaisuissa sitä ei edes esitetä erillisenä osana Notch-reseptoreissa.” Lisäkokeiden avulla he saivat selville, että kun Notch1 aktivoituu ja sen solunsisäinen domeeni vapautuu, sen TMD kokoaa kalvossa kompleksin VE-kadheriinin, Rac1:n, LAR:n ja Trion proteiinien kanssa, jotka yhdessä kokoavat ja ylläpitävät solujen välisiä adherens-liitoksia ja jakavat aktiinisäikeitä solukalvoa vasten tukeakseen näitä liitoksia.
”Jälkikäteen ajateltuna heitimme noppaa tämän hankkeen kanssa, sillä valitsemalla Notchin tutkimisen astuimme yhdelle biologian ruuhkaisimmista tutkimusalueista. Mutta insinööripohjainen lähestymistapamme mahdollisti sen tutkimisen uudella tavalla, ilman aiempien töiden vaikutusta tai ennakkoluuloja, mikä mielestäni sai meidät tarpeeksi ennakkoluulottomiksi havainnoimaan ja luonnehtimaan tätä uutta, odottamatonta reittiä”, Polacheck sanoo. ”Tieto siitä, että Notch1 säätelee solujen adheesiota solujen erilaistumisen lisäksi, tarjoaa myös uudet puitteet monimutkaisten soluprosessien koordinoinnin ymmärtämiselle, sillä yksittäisillä molekyyleillä, kuten Notchilla, voi olla useita eri rooleja”, Kutys lisää.
Havainto siitä, että Notch1:llä on erilaisia toimintoja, ja se, että tiedetään, mitkä proteiinin osat säätelevät kutakin toimintoa, antaa mahdollisuuden kehittää uusia lääkkeitä, jotka ovat sekä tehokkaampia että vähemmän myrkyllisiä. ”Notch on joidenkin syöpähoitojen kohteena, mutta näiden lääkkeiden tiedetään aiheuttavan turvotusta ja muita ongelmia. Työskentelemme nyt aktiivisesti Notchin kahden reitin erottamiseksi toisistaan, jotta voimme luoda lääkkeitä, jotka kohdistuvat pelkästään solunsisäiseen domeeniin ja säästävät TMD:tä, jolloin verisuonten eheys säilyy”, sanoo Karen Hirschi, tohtori Karen Hirschi, lääketieteen ja genetiikan professori Yalen lääketieteellisestä tiedekunnasta, joka osallistui tutkimukseen. Tieto siitä, että Notch säätelee verisuonten läpäisevyyttä, tekee siitä ehdokkaan uusille lääkkeille myös sydän- ja verisuonitautien hoitoon, ja tutkimusryhmä tutkii myös TMD:tä itsessään mahdollisena terapeuttisena aineena, sillä solumallit, jotka altistettiin vuotoa aiheuttavalle tulehdukselle, vähensivät vuotoa dramaattisesti, kun niitä muokattiin ilmentämään TMD:tä.
”Yhteistyö, jota Wyss-instituutti mahdollistaa ja vaalii toisistaan poikkeavien alojen, kuten konetekniikan ja molekyylibiologian, välillä, edistää uusia lähestymistapoja vanhoihin ongelmiin, jotka voivat johtaa todella paradigmaa mullistaviin tuloksiin”, sanoo tohtori Donald Ingber, Wyss-instituutin perustajajohtaja ja Harvardin lääketieteellisen tiedekunnan Judah Folkmanin verisuonibiologian professori ja Bostonin lastensairaalan verisuonibiologian ohjelma, joka on myös Harvardin Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS) biotekniikan professori. ”Tämä tutkimus on malliesimerkki siitä, millaisia hyötyjä tämäntyyppiset kumppanuudet voivat tarjota tieteelle ja yhteiskunnalle.”
Tutkimuksen kirjoittajiin kuuluvat lisäksi tohtori Jinling Yang, joka on Wyss-instituutin postdoc-tutkija; tohtori Jeroen Eyckmans, entinen Wyssin postdoktorinen tutkija ja nykyinen ryhmänjohtaja Bostonin yliopistossa; Yinyu Wu, jatko-opiskelija Yalen genetiikan laitoksella; ja Hema Vasavada, laboratoriopäällikkö Yalen lääketieteellisessä tiedekunnassa.
Tätä tutkimusta on tuettu National Institutes of Healthin (NIH), National Science Foundationin (NSF), Ruth L. Kirchstein National Research Service Awardin, The Hartwell Foundationin ja Harvardin yliopiston Wyss-instituutin myöntämillä apurahoilla.
- JULKAISU – Nature: Ei-kanoninen Notch-kompleksi säätelee adherens-liitoksia ja verisuonten esteen toimintaa