Tehokkaan tavan löytäminen immuunihylkimisen estämiseksi on yksi tärkeimmistä strategioista kliinisten elinsiirtojen tukemiseksi. Äskettäin tehdyt elinsiirtoja koskevat tutkimukset osoittivat, että DPPIV-inhibiittorin tai anti-CD26 mAb:n käyttö lisäsi luovuttajasolujen tarttumista ja vähensi akuuttia GVHD:tä, ja osoittivat CD26:n uudeksi hoitokohteeksi terapeuttisessa interventiossa GVHD-taudissa.11 CD26:n roolin selvittämiseksi allogeenisen siirteen hyljintätilanteessa käytettiin CD26:n tyrmääviä (knockout-hiiriä) allogeenisen ihosiirteen siirtotutkimuksessa. Havaitsimme, että CD26-/-hiirillä oli vähemmän nekroottisia siirteitä ja allograftin hylkiminen viivästyi (kuva 1).
CD26 on T- ja B-lymfosyyttien ja NK-solujen aktivaatiomarkkeri. Kostimulatorisena molekyylinä CD26 välittää T-solujen signaalinsiirtoprosesseja vuorovaikutuksessa adenosiinideaminaasin, CD45:n, kaveoliini-1:n tai CARMA1:n kanssa.5 CD26-välitteisen T-solujen ko-stimulaation esto indusoi anergiaa CD4+ T-soluissa.24 Tässä työssä CD26-/-hiirten MPBL:ssä ja MSL:ssä havaittiin CD26- ja MSL:ssä CD3+- sekä CD4+-solujen alhaisempi prosentuaalinen osuus niin ennen kuin ennen kuin ja sen jälkeen, kun ne olivat saaneet ihonsiirrosta tehdyn transplantaation jälkeen (kuva 3). Lisäksi CD3+- ja CD4+-solujen infiltraatio havaittiin vähäisemmässä määrin CD26-/-hiirten siirtokudoksissa kuin CD26+/+-hiirillä ihonsiirron jälkeen (Kuva 7b, c). Tämä havainto osoittaa, että CD26-puutos johtaa CD4+-solujen heikentyneeseen kehitykseen, kypsymiseen ja toimintaan, mikä vastaa aiempia havaintojamme.23 Mielenkiintoista on, että CD8+-solujen prosenttiosuus CD26-/-hiirten MPBL:ssä oli sama kuin CD26+/+-hiirillä ennen ihonsiirtoa; prosenttiosuus oli kuitenkin huomattavasti pienempi CD26-/- kuin CD26+/+-hiirillä ihonsiirron jälkeen (kuva 3). CD8+-solujen infiltraatiomäärä ihosiirteissä oli selvästi pienempi CD26-/- kuin CD26+/+-hiirillä ihonsiirron jälkeen. Nämä havainnot viittaavat CD8+-solujen heikentyneeseen proliferaatioon, aktivoitumiseen ja toimintaan CD26-/-hiirissä vasteena allogeenisille antigeeneille. CD8+ T-solut ovat merkittävä osa allogeenisen T-solurepertuaaria, joka indusoituu hiirten allogeenisen siirron jälkeen; niiden sytotoksinen aktiivisuus kohdistuu luovuttajan suuren histokompatibiliteettikompleksin (MHC) luokan I peptideihin.25 CD26-/-hiirten CD8+-solujen pienentynyt prosentuaalinen osuus (kuvio 3) allogeenisen siirron jälkeen voi osaltaan selittää siirrännäisten vähentynyttä nekroottisuusastetta ja viivästynyttä allogeenisen siirteen hylkimistä. Lisäksi MSL:n CD3+-, CD4+- ja CD4+NK1.1-solujen prosenttiosuudet olivat CD26-/-hiirillä pienemmät kuin CD26+/+-hiirillä ennen siirtoa, mutta ero pieneni siirron jälkeen. On raportoitu, että CD26:n estäminen lisäsi luovuttajasolujen homingia ja paransi allogeenista engraftmentia.26 MSL:ien CD3+- ja CD4+-solujen prosentuaalisen eron pieneneminen näiden kahden hiirityypin välillä siirron jälkeen voi johtua näiden solujen lisääntyneestä homingista pernaan CD26-/-hiirissä.
Allograftin hyljintää ohjaavat ensisijaisesti isännän T-solut. Vaikka kaikki synnynnäisen ja adaptiivisen immuunijärjestelmän osat osallistuvat siirteen hylkimiseen, T-lymfosyytit ja erityisesti CD4+-solut ovat tässä prosessissa ensiarvoisen tärkeitä.27 Aktivoituaan CD4+-T-solut ohjaavat ensisijaisesti vasteen etenemistä erittämällä sytokiineja, jotka aktivoivat, laajentavat ja/tai rekrytoivat muita efektorisoluja, kuten makrofageja, CD8+-T-soluja ja B-soluja.27, 28 Analysoimalla tarkemmin sytokiinitasoja molemmissa hiirityypeissä havaittiin, että CD26-/-hiirten seerumissa havaittiin selvästi vähentynyt IL-2:n, IFN-γ:n, IL-6:n, IL-17:n, IL-4:n ja IL-13:n eritys allogeenisen siirron jälkeen (kuva 4). Tämä vähentynyt eritys saattoi johtua CD26-/-hiirten pienemmästä CD4+-solujen määrästä ennen siirtoa; on kuitenkin otettava huomioon CD4+-solujen heikentynyt erilaistuminen ja toiminta vasteena allogeeniselle antigeenille CD26-/-hiirissä. Seerumin alhaiset IL-2-, IFN-γ- ja IL-6-pitoisuudet viittaavat Th1-solujen osittain puutteelliseen erilaistumiseen ja toimintaan, kun taas alhaiset IL-4- ja IL-13-pitoisuudet viittaavat Th2-solujen riittämättömään erilaistumiseen ja toimintaan CD26-/-hiirissä.
Keskeisenä sytokiinina IFN-γ:llä on moninaisia ja potentiaalisesti keskenään ristiriitaisia vaikutuksia elimen siirtoallograftin hyljintään.29 IL-2 on toinen Th1-assosioitunut sytokiini, jolla on myös monimutkaisia vaikutuksia allograftin hylkimiseen.30 Sekä IFN-γ että IL-2 ovat pleiotrooppisia sytokiineja, ja niillä on tärkeä rooli T- ja B-solujen lisääntymisessä tulehdusreaktion aikana. Sytokiinit toimivat ensin T-solujen kasvua käynnistävinä molekyyleinä ja selviytyvät immuunivasteen aikana, minkä jälkeen ne vahvistavat Th1-vastetta positiivisella palautteella.29, 30 Akuutissa hyljintätilanteessa Th1-solut soluttautuvat pääasiassa siirteisiin, jolloin IL-2 ja IFN-γ voivat indusoida NK-solujen ja makrofagien aktivoitumista, jotka ovat vahvoja aseita allograftin tuhoamisessa.29, 30 Lisäksi IFN-γ indusoi luokan II MHC-molekyylien ilmentymistä ja IgG2a:n ja IgG3:n erittymistä aktivoituneista B-verisuonista. Akuutissa hylkimismallissa IFN-γ-/-hiiret osoittivat viivästynyttä ihonsiirteen hylkimistä.31 Useissa tutkimuksissa on raportoitu, että toleranssi allograftin hylkimistä vastaan välittyy ainakin osittain IL-4:n, Th2-soluille tyypillisen sytokiinin, avulla edistämällä IL-10:n ja IgG1:n tuotantoa.32 Toiset tutkimukset ovat antaneet keskenään ristiriitaisia tuloksia, ja niissä on saatu viitteitä siitä, että Th2:n inhibiittorin anto pidentää sydänallograftin eloonjäämistä.33 IL-13, jolla on samankaltaisia vaikutuksia kuin IL-4:llä, on toinen Th2-vasteeseen liittyvä sytokiini; IL-13:lla on sama reseptoriketju (IL-4R α-ketju) kuin IL-4:llä, mutta se eroaa osallistuvien kohdesolujen osalta, mikä johtaa erilaisiin biologisiin tapahtumiin.32 Yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä Th1- että Th2-solujen sytokiinit, kuten IL-2, IFN-γ ja IL-4, kykenevät tukemaan B-solujen klonaalista laajenemista ja vasta-ainesynteesiä.28, 34 CD26:n puutos johtaa Th1- ja Th2-solujen heikentyneeseen erilaistumiseen ja toimintakykyyn CD26-/-hiirissä. Th1-sytokiinien IFN-γ:n ja IL-2:n alhaiset tasot voivat johtaa CD8+-solujen proliferaation vähenemiseen (kuva 3) ja makrofagien aktivoitumiseen, mikä vähentää CD8+-solujen ja makrofagien infiltraatiota siirteisiin (kuva 7) allograftin hyljinnän aikana. Toisaalta CD26-/-hiirten alhaiset IFN-γ-, IL-2- ja IL-4-pitoisuudet allogeenisen siirron jälkeen voivat heikentää B-solujen aktivoitumista ja erilaistumista, mikä vähentää vasta-ainetuotantoa (kuva 2).
Immuunihyljintä on monimutkainen prosessi, johon liittyy sekä solu- että humoraalinen immuunivaste ja jolle on ominaista B-lymfosyyttien vasta-aineiden tuotanto. IgG:llä, joka on seerumin IgG:n pääkomponentti ja yleinen patogeeninen vasta-aine potilailla, joilla on elinsiirron hyljintää, on välttämätön rooli siirteiden vaurioittamisessa elinsiirron hyljinnän aikana.35 Tässä työssämme CD26-/-hiirten seerumissa havaittiin vähäistä IgG:n ja sen alaryhmien, IgG1:n ja IgG2a:n, tuotantoa (kuva 2). Tämä tulos vastaa aiempia havaintojamme, jotka osoittivat, että vasta-ainetuotanto oli selvästi vähäisempää CD26-/-hiirillä kuin CD26+/+-hiirillä joko ovalbumiini-immunisoinnin tai pokeweed-mitogeenin stimulaation jälkeen.23, 36 Tämä havainto viittaa siihen, että B-solujen erilaistuminen oli heikentynyt CD26:n puutteen vuoksi. T-soluista riippuvaisessa B-soluaktivaatiossa tarvitaan B-solujen ja Th-solujen välistä vuorovaikutusta ja tiettyjä Th1- ja Th2-sytokiineja tukemaan B-solujen klonaalista laajentumista ja vasta-ainesynteesiä. CD26-/-hiirillä Th-solujen (CD4+) alhainen prosenttiosuus (kuva 3) ja IL-2:n ja IL-4:n alhainen tuotanto (kuva 4) voivat johtaa B-solujen heikentyneeseen aktivoitumiseen ja erilaistumiseen, mikä vähentää IgG-tuotantoa. IgG on tärkeä komponentti, joka välittää allorekognitiota eksogeenisten antigeenien ja vastaanottajan CD8+-solujen välillä siirteen hylkimisen aikana.37 Alhainen IgG-tuotanto CD26-/-hiirillä (kuva 2) voi siksi johtaa siihen, että efektorisolujen hyökkäys siirteen kimppuun vähenee.
Mielenkiintoista on, että IL-10:n eritystaso oli korkeampi CD26-/-hiirillä (kuva 4G). Tuloksiamme tukien CD26/DPPIV-blokkauksen on osoitettu parantavan keuhkojen allograft-siirtoa ja lisäävän IL-10:n ilmentymistä.38 IL-10:n tiedetään olevan anti-inflammatorinen sytokiini; IL-10:n on raportoitu alentavan Th1- ja Th17-sytokiinien ilmentymistä tulehdusprosessissa, erityisesti Treg-solujen signaloinnin aikana.39 Erilaiset solutyypit tuottavat IL-10:tä, mukaan lukien Th2- ja makrofagit sekä säätelytason T-solut.40 CD26-/-hiirillä IL-10:n korkea eritys (kuva 4g) saattoi johtua Treg-solujen suuresta osuudesta (kuva 6). Huomionarvoista on, että vastauksena allogeeniseen elinsiirtoon CD26+/+-hiirten seerumissa havaittiin korkeat IL-6-pitoisuudet ensimmäisestä päivästä alkaen ja ne olivat korkeimmillaan seitsemäntenä päivänä elinsiirron jälkeen; sen sijaan CD26-/-hiirten seerumissa havaittiin vain pieni määrä IL-6:ta seitsemänteen päivään elinsiirron jälkeen (kuva 4d). Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että IL-6:lla on erittäin tärkeä rooli IL-17:ää tuottavien Th17-solujen ja Treg-solujen välisen tasapainon säätelyssä41. Näin ollen tässä tutkimuksessa CD26-/-hiirillä havaittu alhainen IL-17-taso ja korkea Tregien prosenttiosuus (kuvat 5 ja 6) ovat voineet osittain johtua IL-6:n heikentyneestä toiminnasta ja IL-10:n liiallisesta aktiivisuudesta.
Lisäksi on raportoitu, että ihmisen Th17-soluille on ominaista korkea CD26:n ilmentyminen,18 joka on ihmisen Tregien negatiivinen valintamarkkeri,19 mikä viittaa siihen, että CD26 osallistuu Th17-solujen erilaistumisessa ja toiminnassa, mutta että se ei ole sidoksissa Treg-soluihin. Siksi ei ole yllättävää, että CD26-/-hiirillä havaittiin heikentynyt tasapaino Th17- ja Treg-solujen erilaistumisessa. Vaikka allograftin hylkääminen on perinteisesti liitetty Th1:n erilaistumiseen, monet viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että Th17-solut ja IL-17 liittyvät läheisesti allograftin hylkäämiseen.42 Th17-solut ovat uudempi lisäys T-soluparadigmaan, kun taas IL-17, joka on keskeinen Th17-sytokiini, on pro-inflammatorinen tekijä.43 Yhä useammat todisteet viittaavat siihen, että Th17-soluilla on osuutta kroonisen allograft-vaurion kehittymisessä useiden erilaisten elinten elinsiirroissa. Th17-solujen välittämän allograftin hyljinnän tunnusmerkki on IL-17:n kyky rekrytoida neutrofiilejä, jotka ovat yksi ensimmäisistä tulehduksellisista efektorisoluista, jotka kykenevät infiltroimaan allograftin elinsiirron jälkeen ja siten aiheuttamaan allograftin vaurioitumisen.42 Sitä vastoin Treg-soluilla on ratkaiseva rooli immuunitoleranssissa ja erilaisten immuunivasteiden negatiivisessa hallinnassa, kun ne tukahduttavat tai laskevat säätelemättömiksi muita efektorisoluja immuunihyljinnän aikana.44 On raportoitu, että CD26/DPPIV:n estäminen edistää TGF-β1:n eritystä, joka on välttämätön Treg-solujen erilaistumiselle.45 CD4+CD25+ Treg-solujen kehittymiseen ja toimintaan tarvitaan haarukkapään transkriptiotekijä (Foxp3).46 IL-10:n on raportoitu olevan tärkeä tekijä FoxP3:n ilmentymisen ylläpitämisessä.47 CD26-/-hiirillä havaittu korkea IL-10:n määrä (kuva 4g) on saattanut edistää FoxP3:n ilmentymistä. Vähentyneen Th17-aktiivisuuden ja lisääntyneen Tregien prosenttiosuuden CD26-/-hiirten MSL- ja MPBL-verisuonissa allogeenisen elinsiirron jälkeen oletetaan olevan tärkein syy siirteen vähäisempään nekroosiin ja viivästyneeseen allograftin hylkimiseen CD26-/-hiirissä.
Tietyt kemokiinit vaikuttavat osaltaan makrofagien infiltraatioon siirteen kudoksiin, kuten monosyyttien kemotaktiset proteiinit (MCP-1, -2, -3), makrofagikolonioita stimuloiva tekijä (M-CSF tai CSF-1) ja kemokiiniligandi 5 (CCL5 tai RANTES (regulated and normal T cell expressed and secreted)).48 DPPIV/CD26:n substraatteina MCP:t ja RANTES voivat typistyä DPPIV:n avulla, minkä seurauksena niiden kemotaktinen vaikutus muuttuu. 3 On havaittu, että CD26/DPPIV voi pilkkoa MCP:n, jolla on aminoterminaalinen Lys, ja se voi johtaa sen kemotaksisuuden inaktivoitumiseen; sen sijaan MCP, jolla on NH2-terminaalinen pGlu, pysyi muuttumattomana.49 CD26:n vaikutusta makrofagien kemotaksisuuteen ihonsiirron aikana osallistuviin makrofagien makrofagien kemotaksisuuteen vaikuttaviin MCP:n eri isomuotoihin olisi tutkittava edelleen. CCL5/RANTESin typistämisen DPPIV:llä raportoitiin vähentävän sen sitoutumista kemokiinireseptoriin 1 (CCR1) ja CCR3:een mutta lisäävän sen sitoutumista CCR5:een, mikä osaltaan edistää makrofagien rekrytoitumista munuaissiirteissä.48. CD26-/-hiirten CD26-puutos vähensi todennäköisesti CCL5/RANTESin CCR5:een sitoutumisen aktiivisuutta ja johti makrofagien infiltraation vähenemiseen siirteisiin.
CD26 on monitoiminen proteiini, jolla on joko entsymaattista aktiivisuutta tai joka on vuorovaikutuksessa eri molekyylien kanssa. Viimeaikaisissa tutkimuksissa on raportoitu, että CD26/DPPIV osallistuu ihon haavan paranemiseen. CD26-/-hiirillä havaittiin suurempi haavan sulkeutuminen, revaskularisaatio ja solujen proliferaatio, ja DPPIV:n estäjä osoitti potentiaalista hyötyä haavan paranemisessa.50 Ihosiirroissa CD26 osallistuu immuunijärjestelmän hylkimisen lisäksi myös haavan paranemisprosessiin; näin ollen CD26:lla on Januksen kaltainen rooli siirteen tarttumisessa ja hylkimisessä. Tässä työssä siirteiden nekroottisuusaste ja IgG:n ja siihen liittyvien sytokiinien pitoisuudet CD26-/-hiirten seerumissa olivat selvästi alhaisemmat kuin CD26+/+-hiirillä. Siirrännäisen jälkeisestä 13. päivästä alkaen siirteet kuitenkin poistettiin ja haavat paranivat nopeasti CD26-/-hiirillä. Tässä työssä havaittua allograftin hylkimisen vähenemistä CD26-/-hiirillä saattaa osittain kumota haavan paranemisen tehostuminen, jossa CD26 osallistuu molempiin prosesseihin.
Johtopäätöksenä tuloksemme viittaavat siihen, että CD26 osallistuu allogeenisen siirteen hylkimiseen. CD26:n puutos johti Th1-, Th2- ja Th17-alipopulaatioiden osittain heikentyneeseen erilaistumiseen, mutta lisäsi Tregien prosenttiosuutta. Th1:n, Th2:n ja Th17:n heikentynyt toiminta puolestaan vaikutti B-solujen erilaistumiseen ja vähensi CD8+-solujen ja makrofagien toimintaa, mikä johti IgG:n vähäisempään tuotantoon ja viivästyneeseen allograftin hylkimiseen CD26-/-hiirissä.