Comptage des cellules viables
Il existe plusieurs façons de dénombrer le nombre de bactéries dans un échantillon. Un comptage des cellules viables permet d’identifier le nombre de cellules en croissance/division active dans un échantillon. La méthode de comptage sur plaque ou plaque d’étalement repose sur la croissance d’une colonie de bactéries sur un milieu nutritif. La colonie devient visible à l’œil nu et le nombre de colonies sur une plaque peut être compté. Pour être efficace, la dilution de l’échantillon original doit être organisée de manière à ce qu’en moyenne entre 30 et 300 colonies de la bactérie cible soient cultivées. Si le nombre de colonies est inférieur à 30, l’interprétation n’est pas statistiquement valable et si le nombre de colonies est supérieur à 300, il y a souvent chevauchement des colonies et imprécision du comptage. Pour s’assurer qu’un nombre approprié de colonies sera généré, plusieurs dilutions sont normalement cultivées. La procédure de laboratoire consiste à faire des dilutions en série de l’échantillon (1:10, 1:100, 1:1000 etc.) dans de l’eau stérile et à les cultiver sur de la gélose nutritive dans un plat scellé et incubé. Les milieux typiques comprennent la gélose Plate Count pour un comptage général ou la gélose MacConkey pour compter les bactéries gram-négatives telles que E. coli. Généralement, un jeu de plaques est incubé à 22°C et pendant 24 heures et un second jeu à 37°C pendant 24 heures. La composition du nutriment comprend généralement des réactifs qui résistent à la croissance des organismes non ciblés et rendent l’organisme cible facilement identifiable, souvent par un changement de couleur du milieu. Certaines méthodes récentes incluent un agent fluorescent afin que le comptage des colonies puisse être automatisé. A la fin de la période d’incubation, les colonies sont comptées à l’œil, une procédure qui prend quelques instants et ne nécessite pas de microscope car les colonies font généralement quelques millimètres de diamètre.
La méthode de la plaque de coulée est utilisée lorsque l’analyse recherche des espèces bactériennes qui se développent mal dans l’air. L’analyse initiale est effectuée en mélangeant des dilutions en série de l’échantillon dans de la gélose nutritive liquide qui est ensuite versée dans des bouteilles. Les bouteilles sont ensuite scellées et posées sur leurs côtés pour produire une surface de gélose en pente. Les colonies qui se développent dans le corps du milieu peuvent être comptées à l’œil après incubation. Le nombre total de colonies est appelé « Total Viable Count » (TVC). L’unité de mesure est l’ufc/ml (ou unités formant des colonies par millilitre) et se rapporte à l’échantillon original. Le calcul de cette valeur est un multiple du nombre de colonies comptées multiplié par la dilution utilisée. Des exemples de comptage de cellules viables sont les plaques d’étalement à partir d’une dilution en série d’une culture liquide et les plaques de coulée. Avec une plaque d’étalement, on effectue des dilutions en série dans un milieu liquide, puis on étale un volume connu du dernier tube de la série de dilutions. Les colonies sur la plaque peuvent alors être comptées et la concentration de bactéries dans la culture originale peut être calculée. Dans la méthode de la plaque de coulée, un échantillon bactérien dilué est mélangé à de la gélose fondue, puis ce mélange est versé dans une boîte de Pétri. Là encore, les colonies sont comptées et le nombre de cellules viables est calculé.