Analyse et description des étapes de la formation du biofilm d’Aspergillus fumigatus à l’aide de la microscopie électronique à balayage

D’un point de vue médical, Aspergillus fumigatus est un pathogène opportuniste des individus immunodéprimés, avec une gravité de la maladie qui dépend du statut immunitaire de l’hôte, démontrant un taux de mortalité de 50 à 95 %. Ce champignon donne lieu à des infections locales, comme les dermatomycoses des ongles ou les kératites fongiques, et à des infections invasives, comme l’aspergillose, et constitue la deuxième cause la plus fréquente d’infections fongiques chez les patients hospitalisés. L’infection par A. fumigatus dans les voies respiratoires peut provoquer une boule fongique pulmonaire, une aspergillose invasive, une aspergillose pulmonaire invasive (IPA), une pneumonie d’hypersensibilité, de l’asthme, une rhinite allergique médiée par l’immunoglobuline E, une pneumonie chronique nécrosante ou une aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA). En outre, il donne lieu à des ostéomyélites et des endocardites.

A. fumigatus développe un biofilm qui peut être l’un des facteurs de virulence les plus importants . Le biofilm d’A. fumigatus élabore des mycéliums noyés dans une CEM in vitro, et la formation de biofilms a été décrite dans des cellules épithéliales bronchiques humaines (HBE) et des cellules épithéliales bronchiques de la mucoviscidose (CFBEC) et chez des patients atteints de mucoviscidose . La formation de biofilms fongiques sur les cathéters et les prothèses contribue au développement d’infections nosocomiales. Par conséquent, la persistance des infections fongiques est due à la capacité d’un champignon à former des biofilms sur une grande variété de dispositifs médicaux et au fait que les cellules persistantes représentent un important mécanisme de résistance. Le traitement soumis à un biofilm établi chez l’hôte nécessite généralement l’administration de concentrations toxiques d’antimicrobiens, et le traitement recommandé comprend le retrait du dispositif souillé ; toutefois, il s’agit d’un processus difficile et coûteux. Les biofilms fongiques constituent donc un problème clinique et économique majeur.

Au cours de la dernière décennie, plusieurs études ont été publiées sur le biofilm d’A. fumigatus, à la fois in vivo (dans des modèles murins, chez des patients atteints d’aspergillose pulmonaire invasive et dans des cultures épithéliales humaines primaires) et in vitro (sur des plaques de polystyrène). En général, ces études concernent principalement le stade de maturité du biofilm et la composition chimique de l’ECM, avec peu d’images des stades du biofilm, mais n’importe laquelle d’entre elles décrit tous les stades de la formation du biofilm. Ainsi, les informations sont différentes des contributions faites par notre groupe de travail .

Les contributions les plus importantes de cette étude sont les suivantes : i) nous fournissons une description de toutes les étapes de la formation du biofilm de A. fumigatus in vitro, au fil du temps, et les étapes sont étayées par des images MEB ; ii) nous avons analysé deux origines différentes d’isolats : l’une provenant de l’environnement et l’autre d’un patient souffrant d’un ulcère de la cornée ; iii) nous signalons des micro-hyphes (isolat clinique) et des structures fongiques qui ont été rarement signalées à ce jour et qui n’ont pas été décrites, à notre connaissance, pour les espèces d’Aspergillus ; et iv) nous fournissons une description de l’étape de dispersion pour la formation de la colonisation du biofilm à de nouveaux points.

Pour analyser l’organisation structurelle du biofilm mature de A. fumigatus (24 h d’incubation à 28 °C et 37 °C), deux souches, l’une provenant du sol et l’autre d’un patient atteint de kératite fongique, ont été examinées par MEB. Un aperçu de la formation des biofilms d’A. fumigatus observés dans cette recherche a montré que ces biofilms se comportaient de manière similaire, que l’isolat provienne du sol ou de la clinique ; cependant, des différences se sont présentées en fonction de la température d’incubation. À 28 °C, le biofilm présentait des étapes similaires à celles décrites dans la croissance microbienne classique : les phases de latence, exponentielle et stationnaire ; la croissance du biofilm était lente et stable avec une faible production d’ECM, et l’organisation structurelle du champignon était simple (Fig. 1). À 37 °C, la courbe de performance a montré une phase de latence (adaptation) et une phase logarithmique (exponentielle) assez variables, ce qui pourrait être une réponse au stress dû à l’incubation à une température élevée ; ainsi, à 37 °C, il y a une réduction de la phase d’adaptation (latence) pour maintenir un champignon viable ; de même, la phase logarithmique, avec une augmentation discontinue et avec les deux comportements est probablement une réponse adaptative . Ainsi, à 37 °C pendant la phase de maturation, il y avait des structures mycéliennes extrêmement organisées, et celles-ci étaient réduites et compactées avec des hyphes qui étaient épaissies et fusionnées en anastomose, et l’ECM était abondant dans sa couverture, entourant et renforçant les structures fongiques (Figs. 3 et 4).

Dans cette étude, nous fournissons des preuves des étapes du biofilm d’A. fumigatus par MEB. Les étapes observées pendant la formation du biofilm sont les suivantes :

Adhérence, co-agrégation cellulaire et production d’EPS

À un stade précoce (Fig. 2/4 h), les conidies adhèrent à la surface de la plaque par une interaction des forces électrostatiques entre les composants structurels de la paroi cellulaire fongique, et cette force d’attraction est faible et, par conséquent, réversible. La liaison irréversible et permanente a été largement décrite dans les adhésines bactériennes spécifiques présentes à la surface des cellules, qui se lient au substrat et aux EPS, qui sont des substances produites par le micro-organisme dans les étapes initiales de la formation du biofilm qui fonctionnent dans l’adhésion des cellules entre elles et au substrat et sont composées de complexes protéine-glucide et de glycoprotéines qui remplissent principalement des fonctions structurelles ou adhésives. Les adhésines participent à la reconnaissance des cellules bactériennes entre elles, notamment en construisant des ponts et en initiant la formation de colonies. Les adhésines sont décrites dans l’adhésion fongique lors de la formation de biofilms. Dans les biofilms de Candida albicans, Candida glabrata et Candida tropicalis, il existe un groupe de gènes d’adhésion impliqués dans la formation de biofilms qui appartiennent à la famille des agglutinininin-like sequence (ALS), qui joue un rôle clé dans ce processus et code pour des protéines possédant les caractéristiques des glycoprotéines adhésives à la surface des cellules. La famille ALS présente chez C. albicans comprend huit gènes (ALS1-ALS7 et ALS9) codant pour de nombreuses glycoprotéines de surface . Chez A. fumigatus, six hydrophobines, comprenant les rameaux RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp et RodFp, ont été identifiées à la surface des conidies. Cette caractéristique hydrophobe permet l’adhésion aux protéines des cellules hôtes, et elles pourraient être impliquées dans l’adhésion à la surface de la plaque de polystyrène et dans l’initiation du processus de formation du biofilm dans tous les cas ou seulement dans deux ou trois d’entre eux. De plus, Gravelat et ses collègues ont décrit cette interaction fongique et ont découvert que l’adhésine MedA contrôle l’adhésion à la plaque de polystyrène, la formation du biofilm et l’expression des gènes de conidiation et qu’elle a des effets difficiles sur le processus de conidiation chez A. fumigatus . L’adhésion, résultant de l’interaction entre les adhésines fongiques et la surface de la plaque, et l’adhésion conidium-conidium déclenche probablement la signalisation et favorise la co-agrégation cellulaire et la production d’EPS, et ces événements sont présentés dans la Fig. 2 (4 h). Dans le même temps, l’EPS accélère la formation de colonies fongiques par la liaison étroite des cellules (Fig. 2 (8-12 h)) .

Germeture conidienne en hyphes et développement

La formation de biofilms nécessite un nombre seuil de cellules pour leur permettre d’être détectées et de générer une réponse, ce qui est un mécanisme de régulation de l’expression génique avec des fonctions spécifiques . Dans la formation du biofilm de A. fumigatus, avant le début de la germination des conidies, la surface des conidies est nettement hydrophobe et est composée de 40 % de groupes méthyles hydrophobes. La germination des conidies d’A. fumigatus entraîne la rupture de la couche hydrophobe protéinique et révèle les parois internes des conidies qui sont essentiellement composées de polysaccharides, qui sont des composants hydrophiles de la paroi cellulaire. Une spore unique en cours de germination présente une pointe hydrophobe. Le conidium perd progressivement son hydrophobie de surface et, ensuite, le nouveau point de croissance présente une coexistence de bâtonnets hydrophobes et de polysaccharides hydrophiles . La germination conidienne en hyphes commence par la formation de tubes germinatifs, comme illustré sur la figure 2 (8-12 h), possédant la nature très hydrophile de la paroi cellulaire, et ils sont censés favoriser la croissance hyphale .

Maturation du biofilm

La maturation du biofilm d’A. fumigatus a été observée à 24 h, ce qui est un temps d’incubation similaire à ceux rapportés par d’autres chercheurs. Les composants structurels comprennent l’ECM, qui est présent dans le biofilm mature et lie les cellules pour former la base structurelle du biofilm, y compris l’EPS et de nombreux mycéliums organisés (Fig. 2 (24 h0) . ECM. L’eau est le composant le plus abondant et, dans le biofilm, elle représente près de 97 %. Dans cet environnement humide, il existe un réseau macromoléculaire ordonné. Les principales fonctions décrites pour l’EPS dans les biofilms bactériens sont les suivantes : adhésion, agrégation cellulaire, cohésion ; rétention d’eau, barrière protectrice comme défenses spécifiques de l’hôte ou agents antimicrobiens, absorption de composés organiques et d’ions inorganiques, activité enzymatique, source de nutriments, échange d’informations génétiques, donneur ou accepteur d’électrons, exportation de composants cellulaires, stockage de l’énergie excédentaire, et stabilisation des enzymes . Dans les biofilms fongiques, toutes ces fonctions ne sont pas encore décrites, mais certaines sont en cours d’étude : les forces cohésives et adhésives de la matrice contribuent à la stabilité architecturale et mécanique du biofilm. Les cellules fongiques sont immobilisées dans la matrice et agissent comme un écosystème fonctionnel en évolution constante et en régulation homéostatique avec des interactions intenses, y compris la communication cellule-cellule, qui agit comme la colle qui maintient les cellules ensemble . La structure du biofilm varie considérablement en fonction du microorganisme qui le produit et des conditions qui entourent ses microhabitats, y compris les différences structurelles associées à la présentation clinique. Au cours des processus infectieux, la MEC assure la protection contre l’hôte, ainsi que la résistance des micro-organismes aux médicaments ; ainsi, la MEC n’est pas seulement un cadre mécanique, mais aussi un régulateur du comportement cellulaire. Les protéines hydrophobes de la matrice sont liées aux récepteurs spécifiques de la surface cellulaire, ce qui entraîne l’adhésion cellule-matrice, laquelle exerce un effet sur la forme, la migration, la prolifération, la survie et le métabolisme des cellules. En outre, l’ECM protège les cellules contre les agressions environnementales, notamment le dessèchement, les rayons ultraviolets (UV), les radiations, l’oxydation, la famine, l’action des prédateurs, les défenses immunitaires de l’hôte et les antibiotiques. Les caractéristiques de l’ECM étaient évidentes dans la Fig. 2 (24 h) et la Fig. 3 et adhéraient aux hyphes fongiques en une gaine contiguë et étaient également observées avec une consistance poreuse (Fig. 2 (24 h)). Dans le biofilm d’A. fumigatus, l’EPS était hautement structuré et avait une production abondante, qui couvrait, entourait et renforçait les structures fongiques ; il agit comme un cohésif pour la fusion des structures hyphes-hyphes (seulement 37 °C). L’EPS se présente avec un aspect muqueux qui adhère complètement et recouvre les hyphes, provoquant une anastomose et fermant la lumière des canaux d’eau (Figs. 2 (24 h), 3, et 4). Dans des études précédentes, notre groupe de travail a décrit le stade de maturation du biofilm d’A. fumigatus, dans lequel des structures similaires ont été observées .

Dans certains micro-consortia, la composition chimique de l’EPS est connue (polymères d’hydrates de carbone, ADN et/ou protéines et, lipides, entre autres) mais d’autres restent à identifier. La surface d’A. fumigatus est composée d’α-1,3-glucanes, de chitine, de chitosan, de galactomannane, de galactosaminogalactane, de mélanine et de protéines. La composition et l’organisation structurelle de la paroi cellulaire sont constamment remaniées ; même si les polysaccharides présents sont les mêmes, leur quantité et leur localisation varient en fonction des conditions de croissance et de l’environnement nutritionnel. Nous avons montré ici la composition chimique du biofilm de A. fumigatus, qui a été observée par la co-localisation des fluorochromes attachés à la chitine, à l’activité métabolique et aux acides nucléiques par CLSM ; de plus, le chevauchement des signaux des fluorochromes a été observé lorsque ceux-ci étaient attachés à deux ou trois d’entre eux (Fig. 5). La fonction décrite pour les polysaccharides, tels que les α 1,3-glucanes, comprenait leur rôle prédominant in vitro dans l’agrégation des hyphes et dans l’agrégation des hyphes dans les biofilms. D’autres polysaccharides de la MEC, dont le galactomannane et le galactosaminogalactane, sont également connus pour leur rôle dans la protection du champignon et dans l’adhésion de ses structures de biofilms aux surfaces. L’ADN extracellulaire (ADNe) est un composant important du biofilm ECM qui maintient l’intégrité structurelle et architecturale de A. fumigatus. L’ADN électronique est créé par autolyse et a été significativement associé aux niveaux de résistance aux antifongiques (Fig. 5). En outre, l’ADN électronique peut constituer un réservoir de gènes pour le transfert horizontal de gènes. L’ADN confère une organisation structurelle plus solide et plus résistante lorsqu’il est co-localisé avec des polysaccharides. L’ADN électronique provient des cellules fongiques en raison de la sécrétion de chitinases par A. fumigatus qui favorise sa libération (Fig. 5) . Dans le biofilm, la modification de la paroi cellulaire exerce un impact essentiel sur la résistance aux médicaments de la paroi cellulaire. Chez A. fumigatus, dans un modèle de biofilm de souris, dans les gènes AfuMDR4 des pompes d’efflux multirésistantes (MDR) associées à la sortie des antimicrobiens, le gène était significativement induit par le traitement au Voriconazole après 24 h . Le marqueur FUN1 a révélé une activité métabolique qui est une communauté vivante (Fig. 5).

Mycélia : Le biofilm présente une structure tridimensionnelle (3D) complexe qui reflète un processus cellulaire coordonné ; le développement et l’expansion mycéliens étaient évidents, ce qui incluait des réseaux compacts de couches hyphales, l’adhésion hypha-hypha, l’anastomose aux deux températures, avec un arrangement spatial optimal – des canaux formés pour fournir l’influx de nutriments et l’efflux de déchets et ainsi stabiliser le biofilm ; à 37 °C, ce canal était plus évident (Figs. 2 (24 h), 3, et 4). De plus, ces structures ont été observées par d’autres chercheurs . Microhyphes : Dans les premiers stades de maturation du biofilm, des structures fongiques irrégulières, telles que les microhyphes, ont été observées dans l’isolat clinique (Fig. 4). Ce fait est pertinent car il y a peu de références aux microhyphes dans la littérature, et c’est la première fois qu’ils ont été décrits chez A. fumigatus. Les microhyphes présentent des altérations du cytosquelette qui génèrent des hyphes courtes et minces aux parois fines et aux extrémités recourbées. Les microhyphes sont associés à une activité enzymatique élevée qui favorise le processus de maturation et la dispersion cellulaire ultérieure au stade du biofilm .

Dispersion cellulaire

Lors de la dispersion cellulaire, une partie du biofilm est détachée, cette partie comprenant les conidies ou les hyphes. Un développement asynchrone du biofilm a été observé, notamment au stade de la maturation du biofilm, lorsque les nouvelles conidies étaient capables de germer, produisant une nouvelle croissance mycélienne et des modifications des hyphes, telles que des boucles (figures 4 et 6). La dispersion cellulaire du biofilm se produit en réponse aux changements environnementaux. Cela permet d’éliminer une substance dangereuse du corps principal du biofilm. Ce processus conduit à la dissémination et à la propagation des cellules du biofilm à un nouvel endroit, ce qui est soutenu par des événements moléculaires complexes. Les biofilms peuvent être considérés comme des enveloppes protectrices des cellules vivantes qui se trouvent en dessous, avec des fonctions extrêmement complexes et innombrables, et ce sont donc des constructions biologiques vraiment remarquables. Les biofilms offrent une protection contre la prédation ou les attaques chimiques et fournissent aux cellules internes un support pour la communication intracellulaire, le flux de nutriments et le transfert de matériel génétique. La dispersion cellulaire dissémine les cellules viables vers d’autres endroits de l’environnement ou au sein d’un hôte où les cellules peuvent se reproduire, facilitant ainsi sa persistance. La dispersion cellulaire se produit en raison de la rareté des nutriments dans l’environnement, et il s’agit donc d’un mécanisme de survie. Par conséquent, la dispersion cellulaire est importante non seulement pour promouvoir la diversité génétique, mais aussi pour échapper à des habitats défavorables, aidant au développement de nouvelles niches et à la persistance du micro-organisme dans un nouvel emplacement .

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