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Specimen Requirements and Procedure

Les tests ELISA sont réalisés dans des plaques de polystyrène, généralement dans des plaques à 96 puits enduites pour lier très fortement les protéines. Selon le type d’ELISA, le test nécessite un anticorps de détection primaire et/ou secondaire, un analyte/antigène, un anticorps de revêtement/antigène, un tampon, un lavage et un substrat/chromogène. L’anticorps de détection primaire est un anticorps spécifique qui ne se lie qu’à la protéine d’intérêt, tandis qu’un anticorps de détection secondaire est un second anticorps conjugué à une enzyme qui se lie à un anticorps primaire qui n’est pas conjugué à une enzyme.

Il y a quatre grandes étapes générales pour réaliser un test immunologique ELISA. Ces étapes sont :

1. Enrobage (avec soit un antigène, soit un anticorps)
2. Blocage (généralement avec l’ajout de sérum albumine bovine )

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3. Détection
4. Lecture finale

La détection est réalisée par l’ajout d’un substrat pouvant générer une couleur. Il existe de nombreux substrats disponibles pour être utilisés dans la détection ELISA. Cependant, les plus utilisés sont la peroxydase de raifort (HRP) et la phosphatase alcaline (ALP). Le substrat de la HRP est le peroxyde d’hydrogène et entraîne un changement de couleur bleue. L’ALP mesure la couleur jaune du nitrophénol après des périodes d’incubation à température ambiante de 15 à 30 minutes et utilise généralement le P-Nitrophényl-phosphate (pNPP) comme substrat.

Entre chacune des quatre étapes ci-dessus, il y a un « lavage » de la plaque en utilisant un tampon, tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et un détergent non ionique, pour éliminer le matériel non lié. Les puits sont lavés deux fois ou plus au cours de chaque étape de lavage, selon le protocole spécifique suivi.

Dans le protocole ELISA, habituellement, une dilution en série des concentrations est placée dans les puits de la plaque. Après la mesure des résultats, une courbe standard à partir des données des dilutions en série est tracée avec une concentration sur l’axe des x en utilisant une échelle logarithmique et une absorbance sur l’axe des y en utilisant une échelle linéaire.

Il existe quatre grands types d’ELISA :

• ELISA direct (plaque recouverte d’antigène ; dépistage d’anticorps)
• ELISA indirect (plaque recouverte d’antigène ; dépistage d’antigène/anticorps)
• ELISA sandwich (plaque recouverte d’anticorps ; dépistage de l’antigène)
• ELISA compétitif (dépistage de l’anticorps)

ELISA direct

Les ELISA directs et indirects commencent tous deux par l’enduction d’antigène sur les plaques ELISA. La première étape de liaison consiste à ajouter l’antigène aux plaques, qui sont incubées pendant une heure à 37 degrés C ou peuvent être incubées à 4 degrés C pendant la nuit. Une fois l’étape d’incubation terminée, l’étape suivante consiste à laver les plaques de tout anticorps potentiel non lié et à bloquer tout site non lié sur la plaque ELISA en utilisant des agents tels que la BSA, l’ovalbumine, l’aprotinine ou d’autres protéines animales. Cette deuxième étape est importante car elle empêche la liaison de tout anticorps non spécifique à la plaque et minimise les résultats faussement positifs. Après l’ajout du tampon, la plaque est relavée, et un anticorps de détection primaire conjugué à une enzyme sélectionnée est ajouté. La plaque est ensuite incubée pendant une heure.

Dans un ELISA direct, l’anticorps de détection primaire se lie directement à la protéine d’intérêt. Ensuite, la plaque est relavée pour éliminer tout anticorps non lié et suivie par l’ajout d’un substrat/chromophore, tel que la phosphatase alcaline (AP) ou la peroxydase de raifort (HRP) à la plaque, ce qui entraîne un changement de couleur. Le changement de couleur de l’échantillon se produit soit par l’hydrolyse des groupes phosphates du substrat par l’AP, soit par l’oxydation des substrats par la HRP. Les avantages de l’ELISA direct comprennent l’élimination de la réactivité croisée des anticorps secondaires et, en raison du nombre réduit d’étapes, il est plus rapide que l’ELISA indirect. Ses inconvénients comprennent sa faible sensibilité par rapport aux autres types d’ELISA et son coût élevé de réaction.

ELISA indirect

Les étapes de l’ELISA indirect sont identiques à l’ELISA direct, à l’exception d’une étape de lavage supplémentaire et des types d’anticorps ajoutés après l’élimination du tampon. Le test ELISA indirect nécessite deux anticorps, un anticorps primaire de détection qui colle à la protéine d’intérêt et un anticorps secondaire lié à une enzyme complémentaire de l’anticorps primaire. L’anticorps primaire est ajouté en premier, suivi d’une étape de lavage, puis l’anticorps secondaire conjugué à une enzyme est ajouté et incubé. Après cela, les étapes sont les mêmes que pour le test ELISA direct, qui comprend une étape de lavage, l’ajout du substrat et la détection d’un changement de couleur.

Le test ELISA indirect a une sensibilité plus élevée par rapport au test ELISA direct. Il est également moins coûteux et plus flexible en raison des nombreux anticorps primaires possibles qui peuvent être utilisés. Le seul inconvénient majeur de ce type d’ELISA est le risque de réactivité croisée entre les anticorps de détection secondaires.

L’ELISA sandwich

Contrairement à l’ELISA direct et indirect, l’ELISA sandwich commence par un anticorps de capture déposé sur les puits de la plaque. Il est appelé « sandwich » car les antigènes sont pris en sandwich entre deux couches d’anticorps (anticorps de capture et de détection). Après avoir ajouté l’anticorps de capture aux plaques, celles-ci sont ensuite recouvertes et incubées pendant une nuit à 4°C. Une fois l’étape de revêtement terminée, les plaques sont lavées avec du PBS, puis tamponnées/bloquées avec de la BSA. Les lavages tampons sont effectués pendant au moins 1 à 2 heures à température ambiante. Enfin, la plaque est lavée avec du PBS une fois de plus avant l’ajout de l’antigène.

L’antigène d’intérêt est ensuite ajouté aux plaques pour se lier à l’anticorps de capture et incubé pendant 90 min à 37 degrés C. La plaque est à nouveau lavée, et l’anticorps de détection primaire est ensuite ajouté à la plaque et incubé pendant encore 1 à 2 heures à température ambiante, suivi d’un lavage tampon. Ensuite, l’anticorps secondaire conjugué à une enzyme est ajouté et incubé pendant encore 1 à 2 heures. La plaque est lavée à nouveau et le substrat est ajouté pour produire un changement de couleur. Le test ELISA sandwich présente la plus grande sensibilité parmi tous les types de tests ELISA. Les principaux inconvénients de ce type d’ELISA sont le temps et les dépenses et l’utilisation nécessaire d’une « paire appariée » (antigène divalent/multivalent) et d’anticorps secondaires.

L’ELISA compétitif

L’ELISA compétitif teste la présence d’un anticorps spécifique des antigènes dans le sérum testé. Ce type de test ELISA utilise deux anticorps spécifiques, un anticorps conjugué à une enzyme et un autre anticorps présent dans le sérum à tester (si le sérum est positif). L’association des deux anticorps dans les puits permet une compétition pour la liaison à l’antigène. La présence d’un changement de couleur signifie que le test est négatif car l’anticorps conjugué à l’enzyme a fixé les antigènes (et non les anticorps du sérum à tester). L’absence de couleur indique un test positif et la présence d’anticorps dans le sérum testé. Le test ELISA compétitif a une faible spécificité et ne peut pas être utilisé sur des échantillons dilués. Cependant, ses avantages sont les suivants : il nécessite moins de purification de l’échantillon, il peut mesurer une large gamme d’antigènes dans un échantillon donné, peut être utilisé pour les petits antigènes et présente une faible variabilité.