Cabinet de génétique humaine Vienne

Recherche de micro-abérrations à l’échelle du génome : Array-CGH

On connaît depuis longtemps des syndromes complexes dus à une multiplication ou à une diminution du matériel chromosomique. Ainsi, dans le cas de la trisomie 21, un chromosome complet est présent en triple exemplaire au lieu de double. Dans les syndromes de microdélétion, tels que les syndromes de Williams-Beuren, Prader-Willi ou Smith-Magenis, il manque des segments plus ou moins définis d’un chromosome, généralement d’une taille submicroscopique de quelques mégabases. Dans le cas des maladies monogéniques, on découvre depuis peu de plus en plus souvent des délétions ou des duplications de certains gènes ou segments de gènes comme étant à l’origine de la maladie.

Les techniques utilisées jusqu’à présent dans le diagnostic de telles modifications de la dose génétique ont leurs limitations : Ainsi, les méthodes de cytogénétique moléculaire comme la FISH ou les méthodes de génétique moléculaire comme la MLPA permettent certes de travailler avec une résolution élevée ou maximale, mais doivent savoir ou supposer a priori quelle zone du génome est concernée. D’autre part, la cytogénétique classique ou la technique CGH (‘comparative genomic hybridization’ : Hybridation comparative de l’ADN du patient et de l’ADN de référence sur des chromosomes en métaphase) couvre l’ensemble du génome, mais la résolution est limitée à environ 5 Mb dans le meilleur des cas en raison de l’utilisation du microscope optique.

Pour pallier ces limites des techniques existantes, la CGH en réseau est une alternative appropriée.

La technique CGH conventionnelle est ici combinée avec l’expérience acquise lors de l’analyse de l’expression au moyen de puces à ADN : Des fragments d’ADN définis immobilisés à la surface d’une lame de verre servent de cibles d’hybridation, le terme ‘array’ se référant à l’agencement régulier de ces fragments en forme de grille. Les fragments sont choisis de manière à couvrir le plus uniformément possible le génome humain.

Pour l’analyse, des quantités à peu près égales d’ADN du patient et d’un ADN génomique de référence sont cohybridées sur la matrice. Comme les échantillons d’ADN du patient et de la référence sont marqués avec des colorants fluorescents différents, une modification numérique dans le génome du patient entraîne, par le biais d’un décalage dans le rapport d’hybridation, un décalage de couleur du signal de fluorescence de certains fragments.

Représentation schématique de la technique CGH en array:

un scanner détecte les signaux de fluorescence et enregistre les décalages de couleur. Un logiciel approprié permet d’associer les signaux à la région du gène et d’afficher le résultat, par exemple sous forme de ‘caryogramme’, qui montre à quel endroit d’un chromosome des modifications ont eu lieu.

Représentation d’un résultat de la CGH en réseau : duplication de la région Xp11-p21.1 (réalisée au ZMG avec CGHAnalytics, Agilent)

Le nombre et la densité des fragments sur le réseau déterminent la résolution de la CGH en réseau. Actuellement, des tableaux couvrant l’ensemble du génome humain sont disponibles avec une résolution allant de 1 Mb à environ 35 kb. L’augmentation constante du nombre de fragments par tableau permettra d’augmenter encore la résolution. Ainsi, les déséquilibres de certains gènes peuvent être détectés de manière fiable.

Applications de la CGH en réseau

La CGH en réseau est donc une technique qui permet d’examiner le génome complet d’un patient avec une haute résolution pour détecter les écarts par rapport à la dose normale de gènes. Elle prend de plus en plus d’importance en tant que méthode de dépistage innovante, bien qu’elle ait d’abord été utilisée principalement dans le diagnostic des tumeurs. En effet, la progression tumorale se caractérise par une accumulation d’aberrations qui peuvent s’accompagner d’une amplification des oncogènes et d’une délétion des gènes suppresseurs de tumeurs.

L’ArrayCGH est particulièrement intéressante pour le diagnostic des cas de retard mental inexpliqué. Dans la cytogénétique standard, des aberrations sont visibles dans environ 5 % des cas chez les patients présentant un retard mental et des signes de dysmorphie supplémentaires ou une accumulation familiale. Le dépistage des sous-télomères par FISH ou MLPA permet de trouver une cause dans environ 5 % des cas supplémentaires. Des études récentes montrent que l’array-CGH, avec une résolution d’environ 1 Mb, permet de détecter des déséquilibres génomiques dans 10 à 15 % des cas chez des patients présentant un caryotype normal et un résultat négatif au niveau des sous-télomères. (voir littérature). On s’attend à ce que ce taux de détection augmente encore avec la résolution croissante des arrays. Certains groupes de travail recommandent déjà d’effectuer la CGH en réseau comme première étape diagnostique en cas de retard mental inexpliqué.

La CGH en réseau ne détecte pas seulement de nouvelles déséquilibres, elle permet aussi de déterminer avec précision la taille de la délétion, la position des points de cassure ou l’origine du matériel supplémentaire en cas de perte ou de gain de zones chromosomiques visibles en cytogénétique. Cela est important pour établir une corrélation génotype-phénotype précise et pour identifier les gènes candidats impliqués dans le développement de la RM et des dysmorphies. Dans le cas de certaines anomalies chromosomiques qui étaient jusqu’à présent considérées comme des translocations « équilibrées », la CGH en réseau a permis de démontrer que du matériel génétique était supprimé ou dupliqué dans la zone des points de cassure et qu’il s’agissait donc d’une translocation non équilibrée. Ainsi, la CGH en réseau permet de préciser et de corriger les résultats cytogénétiques.

Alors que les frontières entre la cytogénétique et la génétique moléculaire s’estompent de plus en plus, le caryotype reste important, car certaines altérations chromosomiques ne peuvent pas être détectées par la CGH en réseau : Les polyploïdies, les véritables translocations équilibrées et les états de mosaïque avec une faible proportion de cellules aberrantes.

En raison du taux de détection élevé sur l’ensemble du génome et du fait qu’il n’est pas nécessaire de procéder à une culture cellulaire nécessitant beaucoup de temps et de travail, la CGH en réseau offre de nouvelles possibilités pour le diagnostic prénatal.

Mais malgré tous les avantages et les possibilités de cette technique d’avenir, il ne faut pas oublier que le saut de la recherche vers le diagnostic ne fait que commencer. Ainsi, la CGH en réseau ne clarifie pas seulement des questions ouvertes, l’interprétation des résultats peut aussi en soulever de nouvelles:

Les études de CGH en réseau ont permis de découvrir que le génome humain contient une proportion inattendue de zones dont le nombre de copies varie chez les personnes phénotypiquement normales (voir littérature). La taille de ces CNV (‘copy number variations’) varie de quelques kilobases à plusieurs mégabases. On estime que chaque individu porte au moins 3 à 11 variations de ce type. Les bases de données répertoriant ces polymorphismes (c’est-à-dire les mutations qui n’ont pas d’effet évident sur le phénotype) commencent tout juste à être créées et sont donc encore incomplètes. Or, lorsque des aberrations sont trouvées dans l’ADN d’un patient par Array-CGH, il est souvent spéculatif de savoir si elles sont réellement responsables du phénotype. Dans la plupart des cas, il est nécessaire d’examiner également l’ADN des parents.

La probabilité qu’une aberration chromosomique soit responsable d’une maladie augmente

• avec la taille de l’aberration
• si elle est présente « de novo », les parents ne portent donc pas cette aberration
• si elle ne figure dans aucune base de données de polymorphismes
• si des gènes pouvant être associés au phénotype observé sont concernés
• si des cas présentant la même aberration ou une aberration similaire sont connus et présentent un phénotype similaire.

Plus la CGH en réseau sera utilisée dans le diagnostic clinique, plus la conception du réseau sera susceptible de s’adapter aux exigences de ce domaine : En évitant les régions CNV connues et en privilégiant les zones chromosomiques et les gènes impliqués dans les retards mentaux et les syndromes dysmorphiques, les arrays deviennent de plus en plus intéressants pour le diagnostic pré- et postnatal.

Notre institut a posé les jalons pour profiter dès maintenant des avantages de la technologie des arrays et pour être en mesure de saisir immédiatement les développements futurs. Nous avons opté pour un équipement technique capable d’évaluer de manière sûre et reproductible même les tableaux à très haute résolution.

N’hésitez pas à nous contacter si vous souhaitez bénéficier de nos services et de notre expérience dans le domaine de la CGH pour tableaux. Nous vous informerons volontiers sur la durée d’une telle étude, les coûts et les designs de puces actuellement utilisables.

Références

Array-CGH en cas de retard mental

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Array-CGH in der Pränataldiagnostik

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