Conversion de l’ARNm en ADNc double brin

La conversion enzymatique de l’ARNm en ADN d’insertion double brin peut être accomplie par un certain nombre de procédures différentes. Toutes impliquent l’action de la transcriptase inverse et la synthèse d’ADNc amorcée par des oligonucléotides. Ensuite, les procédures d’usage courant divergent considérablement. Il existe un certain nombre de méthodes pour synthétiser le second brin et plusieurs procédures pour produire des extrémités appropriées pour la fabrication d’ADN clonable. Les principaux objectifs de ces procédures sont de construire un ADN d’insertion aussi long que possible, avec un rendement élevé de conversion de l’ARNm en ADN pouvant être ligaturé à l’ADN du vecteur. Les protocoles suivants ne nécessitent que des réactifs disponibles dans le commerce et permettent généralement de produire de bonnes bibliothèques d’ADNc. Le protocole de base décrit une méthode de fabrication d’un ADNc à extrémité émoussée qui peut ensuite être ligaturé à des lieurs pour un clonage ultérieur dans un site de restriction unique tel que EcoRI. Le protocole alternatif est une variante qui nécessite moins de manipulations enzymatiques et permet la construction de bibliothèques d’ADNc directionnelles, ce qui est particulièrement souhaitable lorsque l’objectif est de générer des bibliothèques d’ADNc d’expression. Le protocole alternatif tire parti d’une amorce de liaison constituée (dans l’ordre de 3′ à 5′) d’une amorce oligo(dT), d’un site de restriction pour l’endonucléase XhoI et d’une répétition (GA)20 pour protéger le site de restriction pendant la génération de l’ADNc à extrémité coupée. Les sites XhoI internes sur les molécules d’ADNc individuelles sont protégés par l’incorporation de 5-méthyl-dCTP dans le mélange de nucléotides du premier brin. Les ADNc résultants ayant des extrémités uniques peuvent être clonés dans des vecteurs digérés par EcoRI /XhoI après ligature des adaptateurs EcoRI à l’extrémité 5′ et digestion par XhoI pour libérer les sites XhoI 3′ qui ont été incorporés dans l’ADNc par le linker-primer. Ces modifications aboutissent à une procédure considérablement simplifiée, nettement plus rapide et plus facile que le protocole de base.