- L’hypoxie provoque une augmentation de l’expression des gènes M. smegmatis recA et des gènes recX
- Construction de souches mutantes ΔrecX et ΔrecA ΔrecX
- Analyse génotypique et phénotypique de M. smegmatis ΔrecX et ΔrecAΔrecX mutants
- Les souches mutantes M. smegmatis ΔrecA et ΔrecA ΔrecX présentent une croissance altérée et un rendement cellulaire réduit par rapport à la souche de type sauvage
- La délétion de recA, mais pas de recX, rend M. smegmatis plus sensible aux agents endommageant l’ADN
- Survie après traitement avec différentes concentrations d’agents endommageant l’ADN
- L’expression des gènes recA et recX est induite par les dommages à l’ADN
- Conclusion
- Les abréviations utilisées sont
L’hypoxie provoque une augmentation de l’expression des gènes M. smegmatis recA et des gènes recX
Au cours de l’infection et de la prolifération, M. tuberculosis est exposé à des conditions de stress physiologiques telles que l’hypoxie et le stress de pH acide, qui pourraient compromettre sa survie38,39,40. Par exemple, un stress hypoxique aigu arrête la réplication de l’ADN et déclenche des dommages robustes à l’ADN41,42,43. Une augmentation de l’expression des gènes de la voie SOS, y compris umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB, et uvrD, commence lors de la lésion de l’ADN44,45,46. À cette fin, le profilage de l’expression génique induite par l’hypoxie chez M. smegmatis et M. tuberculosis pendant l’infection latente a fourni des indications précieuses sur la nature du bacille tuberculeux latent et son traitement47.
Des études antérieures chez M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 et Streptomyces lividans50 ont démontré que recA est co-transcrit avec recX. En outre, une surexpression de RecA (un régulateur positif de la réponse SOS) s’est avérée toxique en l’absence de RecX chez certaines espèces bactériennes, notamment Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 et Xanthomonas oryzae53. Ces résultats sont cohérents avec l’idée que RecX agit comme une anti-recombinase pour réprimer les événements de recombinaison inappropriés promus par RecA14. En revanche, une surexpression de RecA dans la souche E. coli ΔrecX n’est pas délétère et la délétion de recX n’affecte pas l’expression de recA54. La transcription de recX dans E. coli est régulée à la baisse par rapport à recA dans des conditions de croissance normales en raison de l’existence d’un site de terminaison de la transcription entre les séquences codantes recA et recX. Cependant, une transcription de l’ARNm recA-recX résultant d’une lecture transcriptionnelle s’accumule dans la gamme de 5 à 10 % du contenu total de l’ARNm recA54. Le transcrit recX était à peine détectable pendant la croissance végétative de E. coli, mais une expression robuste de recX se produit après un traitement avec des agents endommageant l’ADN15,55.
Les génomes de M. smegmatis et de M. tuberculosis contiennent chacun une seule copie de recA et de recX dans un seul opéron. Pour étudier l’expression et la régulation de ces gènes en cas de croissance aérobie et hypoxique chez M. smegmatis, un modèle de substitution couramment utilisé pour M. tuberculosis, l’abondance relative de l’ARNm à différentes phases de croissance a été mesurée par un test RT-qPCR et normalisée par rapport à celle du gène de l’ARNr 16S exprimé de manière constitutive. Les valeurs de seuil de cycle (Ct) pour les ARNm recA et recX de M. smegmatis ont été normalisées par rapport à la valeur Ct du gène de l’ARNr 16S. Contrairement à E. coli15,55, une quantité significative de transcriptions de l’ARNm recA a été observée en début de phase logarithmique dans des conditions de culture aérobies et hypoxiques (Fig. 1A). Il est intéressant de noter que les conditions hypoxiques ont augmenté l’accumulation de l’ARNm recA de 1,5 fois à la phase mi-log, et ont diminué par la suite lorsque les cellules sont entrées dans la phase stationnaire. Un schéma similaire a été observé pour l’abondance de l’ARNm recX dans des conditions aérobies et hypoxiques, bien qu’à des niveaux réduits (Fig. 1B). Ces observations soutiennent l’idée que les deux gènes sont co-transcrits et régulés de manière coordonnée dans des conditions de croissance aérobies et hypoxiques. De manière intrigante, aucune différence n’a été observée dans les quantités d’ARNm dans des conditions de croissance aérobies et hypoxiques au début de la phase logarithmique. Les profils transcriptionnels des gènes marqueurs spécifiques de la phase de croissance de M. smegmatis (sigH2 et sigH7)56 ont été utilisés pour déterminer les moments de la phase pré-log, mi-log et stationnaire (Fig. 1C). Dans les souches cliniques multirésistantes de M. tuberculosis, on a constaté que les niveaux d’ARNm recA et recX étaient plus élevés que dans les souches sensibles aux médicaments et que les niveaux d’ARNm recX augmentaient en même temps que l’ARNm recA57.
Cependant, il faut noter que les niveaux d’ARNm ne peuvent pas être utilisés comme substituts des niveaux de protéines correspondants. Par conséquent, l’abondance des protéines RecA et RecX dans M. smegmatis a été mesurée dans des conditions aérobies et hypoxiques par un test Western blot utilisant des anticorps anti-RecA et anti-RecX. GroEL a été sondé en tant que contrôle de charge protéique. L’analyse densitométrique des immunoblots a révélé que les cellules accumulaient des niveaux plus élevés de RecA dans des conditions de croissance hypoxique par rapport aux conditions aérobies (Fig. 2A,B). Une analyse comparative a montré que les cellules accumulaient systématiquement des niveaux de RecA 2 fois plus élevés dans les phases logarithmiques moyennes par rapport à la phase logarithmique précoce dans des conditions de croissance aérobies, qui diminuaient dans la phase stationnaire pour atteindre les niveaux observés dans la phase logarithmique précoce (Fig. 2A,B). Un schéma similaire a été observé pour RecX, bien que les niveaux soient moins prononcés que ceux de RecA (Fig. 2A,C). Bien que les profils d’expression de l’ARNm et de la protéine soient comparables, des différences importantes ont été notées. Tout d’abord, la protéine RecX était difficilement détectable en début de phase logarithmique dans des conditions hypoxiques. Deuxièmement, l’abondance de l’ARNm et de la protéine RecA était plus élevée par rapport à celle de RecX.
Bien que ces résultats suggèrent que les gènes recA et recX de M. smegmatis sont induits dans des conditions hypoxiques, il n’y a pas de corrélation entre la quantité d’ARNm recX et la protéine correspondante dans la phase précoce-log. Il a été démontré que M. tuberculosis et M. smegmatis stabilisent tous deux la transcription de leur ARNm dans des conditions d’inhibition de la croissance58,59,60. Parmi les mécanismes possibles, il a été démontré que la reprogrammation de l’ARNt et la traduction sélective biaisée par les codons jouent un rôle chez les mycobactéries en réponse à l’hypoxie61. Une explication possible de l’absence de corrélation entre l’ARNm recX et le niveau de protéine au début de la phase logarithmique pourrait être due à la répression traductionnelle de l’ARNm recX.
Construction de souches mutantes ΔrecX et ΔrecA ΔrecX
La différence des niveaux de protéine RecA et RecX chez M. smegmatis indique une régulation possible de l’expression des gènes au niveau de la transcription. Dans de nombreuses bactéries étudiées jusqu’à présent, le gène recX est situé sur le même brin codant en aval de recA et les deux gènes sont co-transcrits48,50,53,54,62,63. Cependant, dans le locus lexA-recA-recX des pathovars de Xanthomonas, chaque gène est exprimé à partir de son propre promoteur64. En outre, chez D. radiodurans65,66, B. subtilis67 et N. gonorrhoeae26, les gènes recA et recX sont séparés par plusieurs centaines de kb de longueur et transcrits à partir de leurs propres promoteurs.
Dans un certain nombre d’espèces mycobactériennes, ainsi que dans quelques autres bactéries, la région 5′ de la séquence codante recX chevauche la région 3′ du gène recA. Ce chevauchement est long de 32 pb chez M. smegmatis48, tandis que chez M. tuberculosis68 et M. leprae69, il est de 35 pb. L’effet de la délétion de recX sur les caractéristiques phénotypiques a été étudié dans divers organismes7,10. Les mutants knock-out de recX présentent une série de phénotypes associés aux fonctions de RecA : l’inactivation de recX de B. subtilis a rendu les cellules sensibles au MMS et à H2O225, les mutants recX de S. lividans ont montré une résistance réduite aux dommages causés par les UV42 et le mutant recX de N. gonorrhoeae a montré une petite diminution de sa capacité à survivre aux dommages causés à l’ADN par les cassures double-brin26. Cependant, l’impact de la délétion des gènes recA et recX sur les caractéristiques de croissance et la réparation des dommages à l’ADN n’a été étudié dans aucun organisme. De plus, le rôle in vivo de recX chez les mycobactéries n’est pas complètement compris.
Des études antérieures ont démontré que la souche ΔrecA de M. smegmatis présentait une sensibilité aux dommages de l’ADN induits par les UV et ne parvenait pas à promouvoir la HR52. Nous avons combiné la mutation recA avec la délétion de recX pour étudier les effets des doubles mutations. À cette fin, nous avons généré des souches de M. smegmatis mc2155 recX simple et recArecX double mutant. Comme contrôle, l’effet de la délétion de recA dans M. smegmatis a été réévalué pour une comparaison directe. En utilisant la méthode de recombinaison, qui est basée sur un protocole développé pour M. tuberculosis et M. bovis BCG28, les mutants M. smegmatis mc2155 ΔrecA et ΔrecAΔrecX ont été générés en utilisant des constructions AES linéaires ΔrecA::hyg et ΔrecAΔrecX::hyg de 3,279 kb et 3,302 kb, respectivement. Environ 100 ng de fragments d’ADN AES linéaires ont été générés par digestion de restriction des plasmides respectifs avec EcoRV (Fig. 3A). Ils ont été transformés dans des cellules compétentes de recombinaison M. smegmatis mc2155:pJV5370. Après 4-5 jours d’incubation, 8-10 colonies résistantes à l’Hyg ont été trouvées pour les mutants ΔrecX et ΔrecAΔrecX. Les souches mutantes putatives ont été criblées par PCR pour déterminer si les gènes recX et recArecX étaient supprimés du chromosome (données non présentées). Les mutants corrects ont été cultivés dans un milieu gélosé Middlebrook 7H10 pendant 5 à 8 générations pour permettre la perte de pJV53.
Analyse génotypique et phénotypique de M. smegmatis ΔrecX et ΔrecAΔrecX mutants
Après criblage par PCR, 2 mutants knockout ΔrecX et ΔrecAΔrecX de M. smegmatis mc2155 ont été obtenus. Les mutants ΔrecX et ΔrecAΔrecX ont été caractérisés par cartographie par enzymes de restriction et hybridation par transfert de Southern (Fig. 3). Après hybridation avec des sondes radiomarquées appropriées, un fragment de 4,1 kb a été observé dans le cas des cellules M. smegmatis mc2155 de type sauvage. Les fragments prédits de 3,14 kb et 2,09 kb ont été observés dans les mutants ΔrecX et ΔrecAΔrecX respectivement (Fig. 3B,C). Ces deux bandes sont plus petites que 4,1 kb, ce qui indique que les gènes recX et recArecX ont été supprimés par remplacement allélique. La fréquence d’échange allélique en ce qui concerne recX et recArecX était de l’ordre de 70% et 80% respectivement.
Une mise en garde de cette analyse est que les effets observés des mutations ΔrecX et ΔrecAΔrecX pourraient résulter des effets polaires de l’insertion du gène de résistance à l’hygromycine. En général, les altérations génétiques autour du locus recA-recX pourraient entraîner des effets polaires sur l’expression des gènes en aval du locus recA-recX. Deux expériences indépendantes ont été réalisées pour étudier les effets polaires potentiels. Premièrement, les mutants ΔrecX et ΔrecAΔrecX ont été complétés avec les copies fonctionnelles des gènes recA et recX. Les transformants ont été évalués pour leur capacité à croître dans un milieu de culture standard et à protéger les cellules mutantes contre l’irradiation UV. Des dilutions en série de dix fois ont été déposées sur des plaques de gélose 7H10 et analysées. Comme le montrent les figures 4A et B, le recA de type sauvage a partiellement complété les souches mutantes ΔrecA et ΔrecAΔrecX, comme le montre leur capacité à soutenir la croissance et à fournir une protection contre l’irradiation UV. Cependant, le recX de type sauvage n’a pas réussi à sauver le phénotype des souches mutantes ΔrecAΔrecX observé lors de l’induction de dommages à l’ADN par irradiation UV. Puisque, la délétion de recX n’a eu aucun effet discernable sur sa croissance dans des conditions normales et de dommages à l’ADN, ΔrecX et sa souche complétée correspondante ont montré une croissance similaire à celle du type sauvage.
Deuxièmement, nous avons évalué l’expression de deux M. smegmatis mc2155, gluD (MSMEG_2725) et glnH (MSMEG_2726), situés en aval du locus recA-recX dans les souches mutantes ΔrecA ΔrecX et ΔrecX par rapport à la souche de type sauvage. Le gène hyd2 de M. smegmatis (MSMEG_2720) situé en amont du locus recA-recX a été utilisé comme contrôle positif. L’ARN total a été préparé à partir des souches de type sauvage, ΔrecA ΔrecX et ΔrecX mutant. Les abondances relatives des transcriptions des gènes ont été déterminées par RT-qPCR quantitative et normalisées par rapport à celles du gène 16S rRNA chromosomique exprimé de manière constitutive. Les niveaux d’expression ont été mesurés à partir de cellules cultivées dans la phase de croissance exponentielle tardive. Dans tous les cas, les profils d’expression génétique des ORF amont et aval étaient similaires pour les souches sauvages et mutantes (Fig. 4C). Pris ensemble, ces résultats excluent la possibilité que l’insertion du gène de résistance à l’hygromycine provoque des effets polaires.
Les souches mutantes M. smegmatis ΔrecA et ΔrecA ΔrecX présentent une croissance altérée et un rendement cellulaire réduit par rapport à la souche de type sauvage
Pour caractériser la souche M. smegmatis ΔrecX et ΔrecA ΔrecX mutants, les profils de croissance des souches de type sauvage et des souches knockout ont été mesurés dans un bouillon Middlebrook 7H9 à 37 °C (Fig. 5). La délétion recX n’a eu aucun effet discernable (par rapport à la souche de type sauvage) sur la croissance de M. smegmatis. Dans des conditions similaires, la délétion de recA a augmenté de façon marquée la durée de la phase de latence et a réduit de façon concomitante la phase de croissance exponentielle, ce qui suggère que recA joue un rôle dans la croissance et la viabilité de M. smegmatis. En outre, ces résultats sont cohérents avec la fonction connue de RecA dans le sauvetage des fourches de réplication bloquées ou effondrées71,72,73. Comme les gènes recA et recX forment un seul opéron, l’impact de leur délétion sur la croissance de M. smegmatis a été étudié. La souche knockout ΔrecA ΔrecX a présenté un phénotype de croissance intermédiaire entre le mutant ΔrecA et la souche de type sauvage ; cependant, la croissance aux phases log tardive et stationnaire était similaire à celle des souches ΔrecA et de type sauvage.
La délétion de recA, mais pas de recX, rend M. smegmatis plus sensible aux agents endommageant l’ADN
Similaire à d’autres eubactéries, la protéine RecA mycobactérienne joue un rôle crucial dans la régulation de la réponse SOS lors de dommages à l’ADN74,75,76,77. Pour vérifier si l’absence de recArecX et de recX affecte la capacité de M. smegmatis à réparer efficacement l’ADN endommagé, les mutants ont été exposés à une série d’agents présentant des mécanismes variés de dommages à l’ADN. Dans ces expériences, le stress a été induit en exposant les souches mutantes ΔrecA, ΔrecX et ΔrecA ΔrecX à une irradiation UV, au MMS, au H2O2 ou à la ciprofloxacine pendant la phase exponentielle (OD600 de 0,6) de la croissance bactérienne. Après 3 heures d’incubation, les cellules ont été lavées et leur viabilité a été évaluée en déposant des dilutions en série décuplées des cultures sur des plaques de gélose Middlebrook 7H10 contenant de l’hygromycine (100 µg/ml). La concentration/dose la plus appropriée d’agents endommageant l’ADN a été déterminée après avoir évalué les différences de viabilité cellulaire entre les souches à l’aide de tests sur plaques. En l’absence d’agents endommageant l’ADN, toutes les souches ont présenté des niveaux similaires de viabilité cellulaire (Fig. 6). En revanche, en présence d’agents endommageant l’ADN, la souche ΔrecA a présenté un défaut de croissance prononcé accompagné d’une diminution de 100 fois de l’efficacité du placage par rapport à la souche de type sauvage. Ce phénotype est cohérent avec la littérature disponible. En revanche, l’effet létal des UV, du MMS ou de la ciprofloxacine, mais pas du H2O2, a été partiellement bloqué par la délétion du gène recX dans la souche ΔrecA. Bien que la raison de l’absence d’effet du H2O2 ne soit pas claire, la concentration utilisée n’était probablement pas assez élevée pour affecter la croissance. Il est intéressant de noter que la souche ΔrecX a présenté un phénotype légèrement plus résistant contre les quatre agents endommageant l’ADN que la souche ΔrecA ΔrecX, ce qui indique un possible gain de fonction dû à la perte du gène recX. Compte tenu de ces résultats, il est évident que recA joue un rôle actif dans la réponse SOS et que la sensibilité des agents endommageant l’ADN est légèrement supprimée dans la souche ΔrecX.
Survie après traitement avec différentes concentrations d’agents endommageant l’ADN
Les mycobactéries subissent un certain nombre de conditions de stress défavorables, telles que les stress oxydatifs, nutritionnels et induits par les médicaments78,79,80,81,82. Pour explorer davantage les différences de viabilité cellulaire, des expériences ont été réalisées dans lesquelles la viabilité cellulaire a été mesurée par des unités formant des colonies (UFC). Tout d’abord, la viabilité des mutants ΔrecA, ΔrecX et ΔrecAΔrecX de M. smegmatis mc2155 a été testée par rapport à celle du type sauvage en leur faisant subir des concentrations croissantes de MMS. Les souches ont été cultivées en présence des concentrations indiquées de MMS, jusqu’à ce que les cultures atteignent une OD600 de 0,6. La viabilité cellulaire a été évaluée en plaçant un nombre prédéterminé de cellules sur des plaques de gélose 7H10. Les cellules ont été jugées vivantes si elles étaient capables de se diviser et de former des colonies. Les mutants, contrairement à la souche de type sauvage, ont montré une sensibilité accrue au MMS d’une manière dépendante de la concentration. L’analyse quantitative a indiqué que le mutant ΔrecA présentait une sensibilité relativement plus élevée au MMS, qui augmentait avec les concentrations de MMS (figure 7A). Dans le cas de ΔrecX, les cellules étaient ~2 fois moins sensibles au MMS par rapport aux cellules ΔrecA. En revanche, le mutant ΔrecA ΔrecX a montré une plus grande sensibilité au MMS, contrairement au mutant ΔrecX. La sensibilité du mutant ΔrecX au MMS indique que recX peut avoir des cibles non encore identifiées en plus de RecA. Cette hypothèse nécessite des investigations supplémentaires.
Puis, les sensibilités du M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX et des souches mutantes ΔrecA ΔrecX par rapport à la souche de type sauvage ont été déterminées en les exposant à des concentrations croissantes de H2O2. Les résultats montrent que le mutant ΔrecA était moins sensible à ce traitement (Fig. 7B). La délétion de recX seule, ou la délétion du locus recA-recX, n’a eu qu’un effet mineur sur la viabilité et la prolifération des cellules mutantes en réponse au traitement par H2O2. Notamment, les souches mutantes ΔrecA et ΔrecAΔrecX ont présenté un phénotype de croissance sensible à l’irradiation UV et à la ciprofloxacine qui est significativement beaucoup plus sévère qu’au MMS ou au H2O2 (Fig. 7C,D). De plus, la souche ΔrecA a montré une plus grande sensibilité à l’irradiation UV et à la ciprofloxacine que la souche double mutante ΔrecA ΔrecX.
L’expression des gènes recA et recX est induite par les dommages à l’ADN
Les éléments régulateurs en amont du gène recA ne sont pas conservés dans toutes les espèces mycobactériennes. Par exemple, le gène recA de M. tuberculosis est transcrit à partir de deux promoteurs : tous deux sont inductibles par les dommages à l’ADN, bien que par des mécanismes différents. Le promoteur P1 de M. tuberculosis recA (proximal du codon d’initiation) peut être induit à la suite d’un dommage à l’ADN, indépendamment des protéines LexA et RecA. En revanche, le promoteur P2 (situé loin du codon de départ de recA) est régulé par LexA, qui est fonctionnellement analogue au promoteur recA d’E. coli83,84,85. Il est intéressant de noter que le mécanisme d’induction des dommages à l’ADN chez M. tuberculosis n’est pas entièrement conservé chez M. smegmatis46,75. Ces résultats soulignent la nécessité de comprendre l’expression et la régulation des gènes recA et recX de M. smegmatis et leurs rôles en réponse aux agents endommageant l’ADN.
Comme décrit ci-dessus, l’hypoxie a provoqué une augmentation de l’expression des gènes recA et recX de M. smegmatis (Fig. 1). Pour corroborer davantage l’idée que l’expression des gènes recA et recX de M. smegmatis est inductible par les dommages, la cinétique de l’induction avec et sans dommages à l’ADN a été déterminée en utilisant la RT-qPCR. Des échantillons d’ARN total ont été préparés à partir de cellules de M. smegmatis récoltées à 0, 3, 6, 9 et 12 h après l’exposition aux UV ainsi qu’à partir de cultures non traitées et analysés comme décrit dans la section Méthodes. Les résultats n’ont révélé aucune différence significative entre les niveaux de transcription de recA et recX dans les cellules non traitées. En revanche, une augmentation marquée des transcriptions des ARNm recA et recX a été observée 3 h après l’exposition aux rayons UV, puis a légèrement diminué par la suite. Une comparaison des données RT-qPCR indique des différences importantes entre les niveaux de transcription des recA et des recX. L’exposition aux rayons UV a entraîné une augmentation d’environ 8 fois de l’ARNm recA par rapport au contrôle, tandis que le recX a augmenté d’environ 3 fois (Fig. 8A,B). Ainsi, bien que les ARNm recA et recX existent dans la même unité transcriptionnelle, ces résultats soutiennent l’idée que la production et/ou la stabilité de la transcription de l’ARNm recX est soumise à un mécanisme de régulation posttranscriptionnel supplémentaire.
Ces résultats nous ont conduits à réaliser des expériences supplémentaires pour déterminer la cinétique d’accumulation des protéines RecA et RecX dans les cellules de M. smegmatis avec ou sans dommages à l’ADN. Des essais de Western blotting ont été réalisés sur des lysats de cellules entières en utilisant des anticorps polyclonaux élevés contre RecA et RecX (Fig. 8C). La quantification des Western blots a montré que les cellules contenaient des quantités significatives de protéines RecA et RecX dans les cellules non induites (Fig. 8D,E). Par comparaison, une augmentation d’un facteur 2 de l’abondance des protéines RecA et RecX (par rapport au contrôle) a été observée dans les cellules 3 h après l’exposition aux rayons UV et a diminué par la suite. Fait important, l’induction des protéines RecA et RecX présentait un schéma rappelant celui observé dans les cellules en conditions hypoxiques (Fig. 2), bien que les mécanismes par lesquels ils endommagent l’ADN soient probablement différents.
Conclusion
De nombreuses études ont démontré que recA et recX remplissent un large éventail de fonctions liées à la réparation et à la recombinaison de l’ADN7,10. A notre connaissance, les stimuli qui activent l’expression des gènes recA et recX de M. smegmatis n’ont pas été identifiés. Dans cette étude, les niveaux d’expression de ces gènes ont été évalués dans des cellules en croissance aérobie et en réponse à diverses conditions de stress. Chez M. smegmatis, comme chez de nombreuses espèces bactériennes, recA et recX appartiennent au même opéron, et le gène recX est situé immédiatement en aval du gène recA, et partagent des régions codantes qui se chevauchent86. On a constaté que les agents endommageant l’ADN induisaient l’expression des deux gènes à des degrés différents ; cependant, les rapports d’expression suivent un schéma similaire. Il est intéressant de noter que les niveaux de RecA et de RecX restent élevés dans des conditions de stress par rapport aux conditions de croissance aérobie.
Plusieurs études ont démontré des rôles alternatifs pour RecX dans la réparation recombinatoire de l’ADN promue par RecA. Alors que la protéine RecX interagit physiquement avec RecA, et fonctionne comme un inhibiteur puissant de toutes les fonctions connues de cette dernière dans de nombreuses espèces bactériennes14,46,48, elle potentialise la recombinaison homologue dans N. gonorrhoeae et B. subtilis25,26. Pour mieux comprendre le rôle de la recX dans la réponse au stress chez les mycobactéries, des mutants knockout de la recX et de la recArecX de M. smegmatis ont été construits. Il est intéressant de noter que la délétion de recX chez M. smegmatis a entraîné un phénotype légèrement plus résistant aux quatre agents endommageant l’ADN, ce qui indique un possible gain de fonction dû à la perte du gène recX. La base moléculaire de cet effet n’est pas claire, ce qui semble intéressant à explorer dans des études futures. Alors que notre analyse était principalement axée sur l’interaction génétique entre recA et recX dans la voie de réparation de l’ADN recombinatoire, il est intéressant de noter que recX semble jouer un rôle important dans la croissance bactérienne. En résumé, ces résultats sont cohérents avec l’idée que le recX de M. smegmatis joue un rôle important dans les processus de réparation/recombinaison de l’ADN dans des conditions défavorables, peut-être en régulant les effets néfastes d’un sous-ensemble de gènes encore inconnus.
Les abréviations utilisées sont
DTT, dithiothréitol ; EDTA, acide éthylène diamine tétraacétique ; kb, kilobase ; MMS, méthylméthane sulfonate ; ODN, oligonucléotide ; PAGE, électrophorèse sur gel de polyacrylamide ; PVDF, membrane en difluorure de polyvinylidène ; RT-qPCR, réaction en chaîne de la polymérase quantitative par transcription inverse ; SDS, dodécylsulfate de sodium ; ADNs, ADN simple brin ; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M citrate de sodium (pH 7,0).