L’importance de la fixation
Pour étudier les tissus au microscope, ils doivent être préservés (fixés) et coupés en sections suffisamment fines pour être translucides. La fixation est une étape critique de la préparation des coupes histologiques. Si elle n’est pas effectuée dans des conditions optimales ou si la fixation est retardée, un spécimen de tissu peut être endommagé de manière irréversible. Quel que soit le soin apporté par la suite au traitement des tissus, à la microtomie et à la coloration, les informations morphologiques et histochimiques pouvant être obtenues à partir du spécimen seront compromises.
L’objectif général de la fixation des tissus est de préserver les cellules et les composants tissulaires dans un « état proche de la vie » ou en altérant le moins possible le tissu vivant, et ce de manière à permettre la préparation de coupes fines et colorées. Le choix du fixateur et du protocole de fixation peut dépendre des étapes de traitement supplémentaires et des analyses finales prévues. Il n’existe pas de fixateur parfait, bien que le formaldéhyde s’en approche le plus. Par conséquent, une variété de fixateurs peuvent être utilisés, selon le type de tissu présent et les caractéristiques à démontrer.
Type de fixation
La fixation des tissus peut être réalisée par des moyens chimiques ou physiques.
Les méthodes physiques comprennent le chauffage, la micro-ondulation et la cryopréservation (lyophilisation).
La fixation chimique est généralement réalisée en immergeant le spécimen dans le fixateur (fixation par immersion) ou, dans le cas de petits animaux ou de certains organes entiers tels qu’un poumon, en perfusant le système vasculaire avec le fixateur (fixation par perfusion). Pour certaines procédures histochimiques spécialisées, les fixateurs ont parfois été appliqués sous forme de vapeur. Par exemple, le paraformaldéhyde et le tétroxyde d’osmium peuvent être utilisés pour fixer en vapeur des tissus lyophilisés.
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Mécanisme de fixation
Les deux principaux mécanismes de fixation chimique sont la réticulation et la coagulation.
La réticulation implique la formation de liaisons covalentes à la fois au sein des protéines et entre elles, ce qui entraîne une rigidification des tissus et donc une résistance à la dégradation.
La coagulation est provoquée par la déshydratation des protéines grâce à l’utilisation d’alcools ou d’acétone. Ces réactifs éliminent et remplacent l’eau libre dans les cellules et les tissus et provoquent une modification de la structure tertiaire des protéines en déstabilisant les liaisons hydrophobes. On parle également de dénaturation.
Facteurs affectant la fixation
- Température : En général, une augmentation de la température a augmenté la vitesse de fixation mais a également augmenté la vitesse d’autolyse et de diffusion des éléments cellulaires. Traditionnellement, 0 à 4 °C a été considéré comme la température idéale ou la fixation des spécimens. Maintenant, la fixation est couramment effectuée à température ambiante.
- Taille : 1-4 mm d’épaisseur
- Rapport volumique : Au moins 15 à 20 fois supérieur au volume du tissu
- Temps : 24 à 48 heures
- pH : Doit être maintenu dans la gamme physiologique, entre pH 4 et 9. Le pH pour la préservation de l’ultrastructure doit être tamponné entre 7,2 et 7,4.
Protocoles
- Méthodes et protocoles de décalcification du matériel osseux
- Protocole standard pour les tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine
Liens utiles
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