Lipoprotéine de basse densité à faible densité comme biomarqueur des maladies athérosclérotiques

Abstract

La lipoprotéine de basse densité (LDL) joue un rôle clé dans le développement et la progression de l’athérosclérose et des maladies cardiovasculaires. Les LDL sont constituées de plusieurs sous-classes de particules de tailles et de densités différentes, notamment les LDL à grande flottabilité (lb) et à densité intermédiaire et petite (sd). Il est bien établi que les sdLDL ont un potentiel athérogène plus important que celui des autres sous-fractions de LDL et que la proportion de cholestérol sdLDL (sdLDL-C) est un meilleur marqueur de prédiction des maladies cardiovasculaires que celle du LDL-C total. Les sdLDL circulantes subissent facilement de multiples modifications athérogènes dans le plasma sanguin, telles que la désialylation, la glycation et l’oxydation, qui augmentent encore leur athérogénicité. Les sdLDL modifiées sont un puissant inducteur des processus inflammatoires associés aux maladies cardiovasculaires. Plusieurs méthodes de laboratoire ont été développées pour la séparation des sous-classes de LDL, et les résultats obtenus par différentes méthodes ne peuvent pas être directement comparés dans la plupart des cas. Récemment, le développement de tests homogènes a facilité l’analyse des sous-fractions de LDL, rendant possible de grandes études cliniques évaluant l’importance des sdLDL dans le développement des maladies cardiovasculaires. D’autres études sont nécessaires pour établir des directives pour l’évaluation et la correction des sdLDL dans la pratique clinique.

1. Introduction

L’incidence élevée de l’athérosclérose et des maladies cardiovasculaires (MCV) associées incite à étudier les causes et les facteurs de risque de leur développement. La croissance de la plaque d’athérome dépend de la captation du cholestérol circulant par les cellules sous-endothéliales. L’hypercholestérolémie est l’un des facteurs de risque bien connus de l’athérosclérose, et le traitement hypocholestérolémiant est largement utilisé dans la pratique clinique pour le traitement des MCV. Cependant, la réduction du risque de MCV obtenue dans la plupart des études cliniques ne dépassait pas 30 %, ce qui indique que d’autres facteurs de risque importants doivent être pris en compte. De nombreuses preuves démontrent que le développement et la progression de l’athérosclérose dépendent non seulement et pas tant de la quantité que des propriétés spécifiques des lipoprotéines circulantes.

Les particules lipoprotéiques circulantes varient en taille, en densité et en composition lipidique et apolipoprotéique et peuvent être séparées en plusieurs classes sur la base de paramètres physiques et chimiques. La lipoprotéine de basse densité (LDL) est la principale source de stockage des lipides athérosclérotiques, tandis que la lipoprotéine de haute densité (HDL) n’est pas athérogène, et son niveau est inversement corrélé avec le risque de MCV athérosclérotique . Les petites LDL denses (sdLDL) sont particulièrement fréquentes dans le sérum des patients atteints d’athérosclérose et sont susceptibles de subir des modifications chimiques qui augmentent leur athérogénicité. L’analyse du profil des LDL plasmatiques peut être effectuée par ultracentrifugation ou électrophorèse sur gel en gradient qui permet de séparer les particules de LDL en fonction de leur densité ou de leur taille. D’autres méthodes ont été utilisées pour évaluer la taille, la charge ou les propriétés chimiques des particules de LDL et seront abordées plus loin dans cette revue. Actuellement, le développement de méthodes de profilage des LDL bon marché et fiables pour la pratique clinique de routine reste un objectif difficile à atteindre.

De nombreuses études cliniques ont été menées pour établir le lien entre la composition des particules LDL circulantes et le risque d’athérosclérose et de développement de MCV. Selon le consensus actuel, 2 phénotypes principaux, A et B, sont définis sur la base du profil plasmatique des LDL, le phénotype intermédiaire A/B se situant entre les deux. Le phénotype A est caractérisé par la prédominance des grosses LDL flottantes (lbLDL) et le phénotype B par la prédominance des sdLDL . Le phénotype B a été signalé dans un certain nombre de maladies, notamment les troubles métaboliques, l’obésité et le diabète de type 2, et est considéré comme un facteur de risque de maladie coronarienne. De plus, ce phénotype est associé à un taux élevé de triglycérides plasmatiques (TG), à une réduction du cholestérol HDL (HDL-C) et à une activité lipasique hépatique élevée. La prédominance des sdLDL est actuellement reconnue comme un facteur de risque de MCV par le National Cholesterol Education Program (NCEPIII). Outre la densité et la taille, la composition chimique des particules LDL peut varier en raison d’une série de modifications qu’elles peuvent subir dans le sang humain. Parmi celles-ci, la lipoprotéine(a) (Lp(a)), qui contient une molécule de lipoprotéine supplémentaire liée de manière covalente à l’apolipoprotéine B, a été caractérisée comme un facteur de risque cardiovasculaire supplémentaire . La détection et la mesure des particules LDL modifiées présentent un intérêt particulier, car ces types de LDL peuvent être un meilleur marqueur de l’augmentation de l’athérosclérose, bien que leur contenu dans le sang puisse être rare par rapport aux LDL natives.

2. Sous-classes de LDL et méthodes de leur identification

Les LDL sont largement définies comme une fraction lipoprotéique dont la densité varie de 1,006 à 1,063 g/ml, qui peut être isolée par diverses méthodes de laboratoire. Cette gamme comprend également la lipoprotéine de densité intermédiaire (IDL) et la lipoprotéine de très basse densité (VLDL). Plus précisément, les LDL sont connues pour avoir une densité de 1,019 à 1,063 g/ml. L’ultracentrifugation et l’électrophorèse sur gel en gradient (GGE) avec leurs modifications sont largement utilisées pour l’analyse des LDL. Dans la plupart des études utilisant ces méthodes, les particules de LDL sont classées en 3 ou 4 sous-classes, y compris les grosses (LDL I), les intermédiaires (LDL II), les petites (LDL III) et, dans certaines études, les très petites (LDL IV) LDL. Les LDL III et les LDL IV (lorsqu’elles sont discernées) sont appelées sdLDL. Cependant, la classification des LDL basée sur différentes méthodes analytiques manque d’uniformité, et il faut être prudent lors de la comparaison des résultats d’études cliniques employant différentes méthodes.

Historiquement, la première méthode qui a permis de séparer les différentes fractions de LDL était l’ultracentrifugation analytique . Dans cette méthode, les particules de LDL sont séparées en fonction de leur taux de flottaison (Sf). Dans les études où trois sous-classes de LDL sont définies, les LDL I, II et III ont des densités de 1,025-1,034 g/ml, 1,034-1,044 g/ml et 1,044-1,060 g/ml, respectivement. Dans certaines études, de très petites particules de LDL IV sont séparées. Le modèle de phénotype A est caractérisé par la prédominance des LDL I et II et le modèle de phénotype athérogène B par la prédominance (>50%) des LDL III et IV. Les différentes méthodes d’ultracentrifugation entraînent de légères variations de la densité des LDL séparées. Par exemple, le gradient d’iodixanol donne des densités de particules de LDL plus faibles que le gradient de sel traditionnel, car les particules conservent leur hydratation native .

Une autre méthode largement utilisée pour l’analyse des sous-fractions de LDL est la GGE dans des conditions non dénaturantes. Dans cette méthode, les sous-classes de LDL sont séparées par leur mobilité électrophorétique, qui est déterminée par la taille et la forme de la lipoprotéine . Les études utilisant la séparation GGE des LDL définissent 4 sous-classes : LDL I (grosses LDL, diamètre maximal 26,0-28,5 nm), LDL II (LDL intermédiaires, 25,5-26,4 nm), LDL III A et B (petites LDL, 24,2-25,5 nm) et LDL IV A et B (très petites LDL, 22,0-24,1 nm). Deux phénotypes peuvent être distingués sur la base du diamètre maximal des particules de LDL : >25,5 nm pour le modèle de phénotype A (grosses et intermédiaires LDL) et ≤25,5 nm pour le modèle de phénotype B (petites et très petites LDL). Il existe une forte corrélation entre la taille et la densité des particules de LDL analysées respectivement par ultracentrifugation et par GGE ; toutefois, ces paramètres ne sont pas identiques. Certains auteurs ont utilisé l’électrophorèse sur gel en tube pour l’analyse des sous-fractions de LDL afin d’obtenir rapidement des résultats quantitatifs.

La résonance magnétique nucléaire (RMN) peut être utilisée pour étudier les classes de lipoprotéines dans le plasma sanguin, y compris les sous-classes de LDL. Cependant, les résultats de la mesure de la taille des particules par RMN diffèrent significativement des données GGE chez les mêmes patients et ne peuvent pas être directement comparés. sdLDL est déterminé par RMN comme des particules avec des tailles de 18,0 à 20,5 nm .

Les autres méthodes d’analyse de la fraction LDL comprennent la chromatographie liquide haute performance (HPLC) avec des colonnes de filtration sur gel , la diffusion dynamique de la lumière , l’analyse de mobilité ionique et l’analyse de dosage homogène . Cette dernière est particulièrement intéressante en raison de sa grande reproductibilité et de sa capacité à être utilisée dans le cadre d’essais cliniques à grande échelle. Le test homogène pour la détection du cholestérol sdLDL a été décrit pour la première fois par Hirano et al. Depuis lors, le test a été modifié pour simplifier la procédure analytique. Dans la méthode modifiée, les sdLDL (taille des particules 15,0-20,0 nm) sont séparées des lbLDL à l’aide d’un détergent et d’un traitement à la sphingomyélinase, et la concentration de sdLDL-cholestérol est mesurée. La méthode sépare la fraction sdLDL avec une densité de 1,044 à 1,063 g/ml en utilisant un équipement de laboratoire clinique standard . La comparaison de certaines des méthodes les plus utilisées pour l’analyse des sous-classes de LDL est présentée dans le tableau 1.

A mesure que l’importance clinique et diagnostique des sous-classes de LDL devient évidente, le problème de la normalisation prend de l’importance. Différentes méthodes d’analyse des sous-classes de LDL donnent des résultats différents, et des variations importantes sont possibles même au sein d’une même méthode. Il est actuellement difficile de déterminer laquelle des approches existantes peut être recommandée comme étant la plus précise et, en même temps, adaptée à une utilisation clinique. De plus, aucune donnée n’est actuellement disponible sur la comparabilité des méthodes d’analyse des sous-fractions de LDL en termes de prédiction de l’évolution des MCV. Par conséquent, d’autres études sont nécessaires pour développer une procédure analytique standard.

3. Origines des sous-classes de LDL

Les origines exactes des sous-classes de LDL restent à élucider. Berneis et al. ont proposé l’existence de deux voies dépendant de la disponibilité des triglycérides (TG) hépatiques . Deux types de lipoprotéines précurseurs (Lp) sont sécrétés par le foie, contenant une apolipoprotéine B (apoB) riche en TG ou pauvre en TG. Lorsque la disponibilité des TG est faible, les VLDL1 (Lp riches en TG) et les IDL2 (Lp pauvres en TG) sont sécrétées. Si la disponibilité des TG est élevée, des particules plus grosses sont sécrétées, comme les VLDL1 (TG-rich Lp) et les VLDL2 (TG-poor Lp). Les Lp pauvres en TG sont un précurseur des sous-classes de LDL les plus grosses (LDL I et LDL II), tandis que les Lp riches en TG sont converties en sous-classes de sdLDL (LDL III et LDL IV) après délipidation par la lipoprotéine lipase (LPL) et la lipase hépatique (HL). La protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) peut transférer les TG aux particules sdLDL qui seront à nouveau délipidées par la HL, ce qui entraîne la génération de particules plus petites (Figure 1) . Cette théorie défend la voie métabolique distincte pour les sdLDL à partir des précurseurs sécrétés par le foie et est soutenue par les résultats d’une étude interventionnelle humaine qui a démontré une corrélation inverse entre les LDL I et les LDL III et entre les LDL II et les LDL IV . En conséquence de la modification par étapes, les particules sdLDL ont des contenus chimiques modifiés, contenant des quantités diminuées de phospholipides (mesurées sur la base de la teneur en apolipoprotéine B), ainsi que de cholestérol libre et d’ester de cholestérol, tandis que les contenus en TG restent inchangés .

Figure 1

Schéma hypothétique des origines métaboliques des sous-classes de LDL. Deux voies métaboliques existent pour la production des particules LDL à partir des précurseurs sécrétés par le foie. En cas de faible disponibilité de TG, le foie sécrète principalement des VLDL1 et des IDL sous forme de particules lipoprotéiques riches en TG et pauvres en TG. Celles-ci peuvent être modifiées par LPL et HL pour générer des particules LDLI et III. En cas de disponibilité élevée de TG, un modèle distinct de précurseurs de LDL est sécrété, y compris des VLDL1 et VLDL2 plus grosses. Après ces modifications par LPL et HL, ils donnent naissance aux particules LDLII et IV. Après le transfert des TG aux particules LDL par la CETP, elles peuvent être encore délipidées par l’HL, ce qui entraîne la formation de particules LDL plus petites. TG : triglycérides ; LPL : lipoprotéine lipase ; HL : lipase hépatique ; CETP : protéine de transfert des esters de cholestérol.

Des études récentes suggèrent que les sdLDL peuvent avoir des origines multiples, du moins chez les patients atteints de troubles métaboliques. Les résultats de l’analyse de la sous-fraction LDL aux jours 0 à 7 après l’aphérèse chez les patients atteints d’hypercholestérolémie familiale ont démontré que la dynamique de rebond des sdLDL pouvait être mieux expliquée par le modèle, combinant la voie directe et la délipidation des lbLDL . La régulation de la production de sdLDL est susceptible de dépendre de l’état métabolique actuel. Le rôle régulateur des lipoprotéines apoE et apoC-III dans le métabolisme de l’apoB a été étudié dans un travail récent sur des sujets sains et des patients atteints d’hypertriglycéridémie . Lorsque les taux plasmatiques de TG étaient normaux, le foie sécrétait principalement des VLDL riches en TG et contenant de l’apoE, qui étaient rapidement éliminés de la circulation. En cas d’hypertriglycéridémie, cependant, l’équilibre s’est déplacé vers les lipoprotéines riches en TG contenant de l’apoC-III, qui avaient des temps de circulation plus longs et étaient converties en sdLDL. La clairance des lipoprotéines contenant de l’apoE a également été réduite. En conséquence, le taux élevé de formation de sdLDL et la réduction de la clairance ont conduit au développement du phénotype B avec des niveaux élevés de sdLDL. Ces observations soulignent l’importance de contrôler l’hypertriglycéridémie pour réduire le risque de MCV. De nombreuses études ont été menées pour évaluer les effets des changements de mode de vie et de régime alimentaire sur la production de TG et de sdLDL et sont passées en revue ailleurs. Il a été démontré que certains composants alimentaires, comme les acides gras polyinsaturés oméga-3, avaient des effets bénéfiques.

Les particules de LDL peuvent être modifiées par la CETP, qui est responsable de l’échange de TG et d’ester de cholestérol entre les LDL et les VLDL et/ou les HDL et les HL. Cela conduit à la production de particules sdLDL plus petites. En conséquence, l’inhibition de la CETP pourrait réduire la fraction sdLDL chez les personnes ayant un faible taux de C-HDL et chez les femmes préménopausées en bonne santé.

Les facteurs génétiques influençant la production de sdLDL ont été étudiés dans des études d’association pangénomique (GWAS) récemment réalisées. On a découvert qu’un polymorphisme nucléotidique simple (SNP) dans la région promotrice de la sortiline, un récepteur de triage impliqué dans la libération hépatique de VLDL, entraîne des altérations de la synthèse hépatique de la sortiline et a une influence sur le profil lipoprotéique. La fraction des très petites LDL était augmentée de 20 % chez les homozygotes de l’allèle majeur par rapport aux homozygotes de l’allèle mineur . D’autres SNP associés à une altération du métabolisme des lipoprotéines ont été signalés dans différents loci, notamment CETP, LPL, LIPC, GALNT2, MLXIPL, APOA1/A5 et PCSK7. Par conséquent, le métabolisme des sdLDL dépend de facteurs génétiques qui pourraient être pris en compte pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

4. Modifications athérogènes des sdLDL

Le temps de circulation des sdLDL est plus long que celui des grosses particules LDL qui sont éliminées de la circulation sanguine par l’interaction avec le récepteur LDL . Le piégeage et l’accumulation des lipides par les cellules spumeuses dans la paroi artérielle sont les processus clés qui conduisent au développement et à la croissance de la plaque athérosclérotique. Les particules LDL sont la principale source de cholestérol stocké dans les plaques et leurs propriétés athérogènes ont été largement étudiées. Il a été démontré que les LDL natives ne provoquent pas d’accumulation de lipides dans les cellules en culture, alors que les particules modifiées, telles que les LDL oxydées, désialylées, glyquées et électronégatives, sont hautement athérogènes. Les formes modifiées de LDL possèdent également des propriétés pro-inflammatoires et sont sujettes à l’agrégation et à la formation de complexes qui augmentent encore leur athérogénicité.

L’oxydation dans le plasma sanguin est l’une des premières modifications athérogènes des particules de LDL qui ont été proposées . L’oxydation entraîne la génération d’épitopes spécifiques de l’oxydation sur les particules de LDL qui induisent la réponse immunitaire et l’inflammation. Les LDL oxydées sont reconnues par un certain nombre de récepteurs, notamment CD36 et TLR-4 . La susceptibilité accrue des sdLDL à l’oxydation peut s’expliquer par leur composition lipidique. En outre, les particules sdLDL contiennent moins de vitamines antioxydantes et sont donc plus sensibles à l’oxydation que les formes plus grandes de lipoprotéines .

L’enrichissement de la phospholipase A2 associée aux lipoprotéines (Lp-PLA2) dans les particules LDL est connu pour être associé aux maladies cardiovasculaires. Des teneurs élevées en PLA2 ont été décrites dans les LDL électronégatifs et également dans les plaques d’athérome avancées. A l’intérieur de la particule lipoprotéique, cette enzyme clive les phospholipides oxydés, libérant des produits pro-inflammatoires et augmentant encore son athérogénicité .

Une autre modification athérogène des LDL est la désialylation, qui est réalisée dans le plasma sanguin par la trans-sialidase qui joue un rôle important dans le métabolisme des glycoconjugués . La trans-sialidase transfère la fraction d’acide sialique de la particule de LDL à divers accepteurs tels que les protéines plasmatiques, les sphingolipides neutres ou les gangliosides. Il a été démontré que l’incubation de LDL purifiées avec du plasma sanguin pendant plusieurs heures conduit à une désialylation progressive des particules. Les sdLDL ont une teneur en acide sialique réduite par rapport aux lbLDL chez les sujets présentant le phénotype B. La désialylation augmente apparemment l’affinité des particules sdLDL pour les protéoglycanes de la paroi artérielle. Par conséquent, les sdLDL désialylées ont un temps de résidence prolongé dans l’espace sous-endothélial où elles peuvent contribuer au stockage des lipides et au développement de la plaque d’athérosclérose .

Il a été démontré que la lipoprotéine apoB est préférentiellement glyquée dans les particules sdLDL par rapport aux lbLDL à la fois in vitro et in vivo , et le niveau d’apoB glyquée est inversement corrélé à la taille des particules mesurée par RMN .

Les origines des niveaux élevés de LDL électronégatives (LDL(-)) dans le plasma des patients athéroscléreux ne sont pas complètement comprises. Plusieurs mécanismes ont été proposés, notamment l’oxydation, la modification du composant protéique et la liaison aux protéoglycanes. La relation entre les LDL(-) et les sdLDL a fait l’objet de plusieurs études. Il a été démontré que les LDL(-) provenant du plasma d’individus sains étaient prédominantes dans la sous-fraction dense, tandis que la plupart des LDL(-) provenant de patients atteints d’hypercholestérolémie se trouvaient dans les fractions LDL légères. Les LDL(-) étaient plus nombreuses dans le plasma des patients présentant un risque élevé de maladie coronarienne. Une autre étude a décrit une distribution bimodale, les LDL(-) étant présentes à la fois dans les fractions LDL denses et légères. Il a toutefois été démontré que l’augmentation de la production de LDL(-) était étroitement liée à l’augmentation des taux de LDL oxydées et de sdLDL .

Des efforts ont été faits pour détecter les formes modifiées de LDL présentes naturellement dans le plasma humain. Les niveaux élevés de Lp(a) ont pu être détectés de manière sélective par des immunodosages développés et optimisés à cet effet . Bien que les LDL oxydées n’aient pas pu être facilement isolées, d’autres types de LDL modifiées ont été purifiées, comme les LDL désialylées et les LDL(-). Les premières ont pu être analysées dans le sérum humain à l’aide d’un test de sorption de lectine et les secondes par des méthodes sensibles à la charge électrique des particules, comme la chromatographie par échange d’ions et l’isotachophorèse capillaire. La teneur en acide sialique des particules isolées de LDL(-) était 1,7 fois et 3 fois plus faible chez les sujets sains et les patients atteints d’athérosclérose, respectivement, par rapport aux LDL natives. En revanche, les LDL désialylées étaient enrichies en LDL(-) . Ces observations suggèrent que les sous-fractions de LDL désialylées et électronégatives pourraient être similaires, voire identiques (tableau 2). De plus, les particules désialylées et les LDL(-) sont toutes deux sensibles à l’oxydation et contiennent moins de vitamines antioxydantes que les LDL natives. Il est donc plausible que les LDL subissent de multiples modifications dans la circulation sanguine, en commençant par la désialylation et l’acquisition de la charge négative, suivies par l’oxydation et la formation de complexes hautement athérogènes et pro-inflammatoires.