Mélange de codons dégénérés pour la manipulation par PCR de séquences hautement répétitives

Résultats et discussion

Le test de ‘flux autophagique’ décrit dans Jiang et al. est un test rapporteur quantitatif de protéine fluorescente verte (GFP) qui mesure les changements ratiométriques de la polyQ-GFP à la GFP libre via une analyse Western blot. Une construction rapporteur multicistronique a été conçue pour coder deux protéines : la polyQ liée à la GFP N-terminale et la GFP libre. La séquence virale 2A (v2A) a été placée comme région de liaison entre les séquences codant pour les deux protéines afin de permettre la traduction stœchiométrique de deux protéines distinctes à partir d’un cadre de lecture ouvert (Fig. 1a) .

Nous avons conçu une séquence polyQ contenant 80 répétitions de glutamine (Q80). La séquence a été conçue pour avoir une faible similarité de répétition en intercalant de manière aléatoire des triplets CAG codant pour la glutamine avec des triplets CAA codant pour la glutamine (figure 1b, c). Les substitutions de nucléotides ont été effectuées à l’œil pour générer un motif semi-aléatoire. Cette conception de séquence non répétitive devrait non seulement améliorer la stabilité de la séquence pendant la propagation dans les bactéries, mais a également permis la conception d’amorces PCR qui s’hybrident à des régions spécifiques de la séquence.

La construction Q80-GFP-v2A-GFP décrite ci-dessus a été synthétisée commercialement (Biomatik Corporation) (voir fichier additionnel 1) et sous-clonée via les sites de restriction BamHI et ClaI dans le vecteur de transfert de gène pT2AL200R150G basé sur le transposon Tol2 (ci-après dénommé Tol2) disponible auprès du laboratoire Kawakami (Fig. 1a et voir le fichier supplémentaire 2).

Les constructions PolyQ avec un nombre inférieur de répétitions de glutamine ont été générées par amplification d’exclusion basée sur la PCR de la construction Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. Les amorces ont été conçues pour amplifier autour du vecteur excluant un nombre défini de répétitions de glutamine pour générer les constructions d’intérêt (Fig. 1d-f). Nous avons cherché à générer des vecteurs avec environ 52 (Q52), 31 (Q31) et 10 (Q10) répétitions de glutamine. Les vecteurs putatifs Q52 et Q31 ont été générés en utilisant la même amorce inverse couplée à différentes amorces directes. Cette amorce inverse commune a amplifié 2 répétitions de glutamine, tandis que les amorces directes ont amplifié les 50 et 29 répétitions de glutamine supplémentaires nécessaires pour générer les vecteurs Q52 et Q31, respectivement. La position de l’amorce inverse a été légèrement déplacée pour optimiser l’amplification du vecteur putatif Q10, de sorte que l’amorce inverse amplifie maintenant 5 répétitions de glutamine tandis que l’amorce directe amplifie les 5 répétitions de glutamine restantes (Fig. 1d-f). En utilisant des températures de recuit strictes dans la réaction PCR, nous avons obtenu une liaison d’amorce spécifique. Les produits PCR extraits du gel et purifiés ont été phosphorylés, circularisés par auto-ligature et ensuite transformés en cellules compétentes (voir le fichier supplémentaire 3). La PCR utilisant des amorces qui flanquent la région polyQ a montré des tailles de produit approximativement attendues pour les vecteurs putatifs Q52, Q31 et Q10 prévus (Fig. 1g). Les constructions générées ont été séquencées pour déterminer si les nombres de répétitions polyQ attendus étaient présents. Alors que la construction Q52 avait le nombre attendu de répétitions de glutamine (Fig. 2a, b), le séquençage a révélé des divergences mineures avec les nombres de polyQ attendus pour les deux autres constructions, où le vecteur Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP avait 21 répétitions de glutamine (ci-après dénommé Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (Fig. 2c, d) et le vecteur Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP avait des répétitions de 11 glutamines (ci-après dénommé Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (Fig. 2e, f). Une analyse plus poussée a révélé que la séquence Q21 générée était dérivée directement de la séquence originale et que la perte des répétitions de glutamine était due à la liaison de l’amorce directe Q31 à 30 pb en aval du site de liaison prédit. En revanche, la répétition de glutamine supplémentaire dans la séquence Q11 a été générée de novo, un ajout d’un codon CAA.

Pour étudier la cinétique d’agrégation et le  » flux autophagique  » de la protéine polyQ in vivo, nous avons injecté les vecteurs polyQ générés (25 ng/μL) et l’ARNm de la transposase (25 ng/μL) dans des groupes d’embryons de poisson zèbre à un stade cellulaire (Fig. 3a, b). Une analyse Western blot avec un anticorps anti-GFP de lysats d’embryons 24 h post-fécondation (hpf) (10 embryons par échantillon) a été réalisée pour chaque groupe. Les embryons injectés et non injectés avec le vecteur Tol2 vide (25 ng/μL) et l’ARNm de la transposase (25 ng/μL) ont été inclus comme témoins. Les embryons injectés avec les constructions polyQ ont produit deux bandes détectées par l’anticorps anti-GFP comme prévu ; la GFP attachée à la polyQ (polyQ80-GFP à ~ 48 kDa, polyQ52-GFP à ~ 38 kDa, polyQ21-GFP à ~ 33 kDa et polyQ11-GFP à ~ 31 kDa), et la GFP libre (~ 27 kDa) (Fig. 3c). Chacun des lysats d’embryons exprimant la polyQ-GFP a également montré une bande plus faible de taille protéique plus élevée correspondant à la longueur complète de la construction polyQX-GFP-v2A-GFP (polyQ80-GFP-v2A-GFP à ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP à ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP à ~ 60 kDa, et polyQ11-GFP-v2A-GFP à ~ 58 kDa). Cette bande représente les ~ 10% de la protéine totale qui est traduite en tant que protéine unique et complète lors de l’utilisation du système de séquence v2A. Les rapports Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP et Q11-GFP:GFP sont respectivement de ~ 5, ~ 4, ~ 2 et ~ 1 (Fig. 3d). Comme la séquence v2A permet la traduction stœchiométrique des protéines polyQ-GFP et GFP, en théorie le rapport polyQ-GFP:GFP devrait être de 1. Les rapports plus élevés observés peuvent indiquer une accumulation de ces protéines. Ces observations sont en accord avec la littérature, où il a été démontré que les constructions de fusion polyQ-GFP contenant plus de 19 résidus de glutamine s’agrègent dans les cellules transfectées d’une manière dépendante de la longueur. Ces observations nous amènent à conclure que nos constructions Tol2-QX-GFP-v2A-GFP constituent un outil utile pour étudier le  » flux autophagique  » in vivo dans un modèle de poisson zèbre larvaire.

Conclusion

En conclusion, cette étude fournit une solution robuste et facilement adoptable pour générer des longueurs proches de celles prévues de répétitions polyQ. Afin de générer des nombres exacts de répétitions de glutamine, des tours ultérieurs d’amplifications avec des séquences d’amorces modifiées peuvent être effectués. En outre, la longueur de l’amorce peut être augmentée pour améliorer la spécificité de l’annelage de l’amorce à la matrice. Notre technique présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes d’amplification des régions répétitives par PCR et vise à minimiser la génération de produits PCR non spécifiques et de répétitions défectueuses en exploitant la redondance des codons du code génétique pour générer une séquence codante d’ADN synonyme avec une répétition réduite. En outre, notre approche n’est pas limitée à la génération de séquences répétées polyQ mais peut également être généralisée pour générer d’autres séquences répétées de nucléotides. En outre, notre méthode est relativement bon marché, car seule la construction initiale polyQ80-GFP-v2A-GFP nécessite une synthèse commerciale, dont le coût dépend du prix par base nucléotidique, de la longueur, de la pureté et de la masse. Tous les autres matériaux requis sont des réactifs standard utilisés pour le clonage moléculaire. En résumé, la technique décrite fournit une solution facile à adopter et abordable pour générer des séquences d’ADN à codage répété qui peuvent être manipulées selon les besoins.