Virus et cellules
Sauf indication contraire, toutes les expériences ont été réalisées avec un isolat de virus de la grippe clinique dans des cellules MDCK A/Memphis/14/96-M (H1N1) aimablement fourni par le Dr Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, USA) . Les virus décrits dans la figure 5 ont été aimablement fournis par les collègues mentionnés dans les remerciements.
Les cellules MDCK et les cellules MDCK-SIAT1 transfectées de manière stable avec la 2,6-sialyltransférase pour une expression accrue des oligosaccharides terminés par Neu5Ac2-6Gal ont été décrites précédemment . Nous avons propagé les deux types de cellules dans du DMEM (Gibco) complété par 2 mM de L-glutamine, 10% de sérum de veau fœtal et des antibiotiques (streptomycine, 100 mg/ml et pénicilline, 100 U/ml).
Milieu de recouvrement
Comme milieu d’entretien (MM) liquide pour l’infection virale, nous avons utilisé le MEM d’Eagle contenant de la L-glutamine, 0,1% de BSA (Sigma, A-0336), des antibiotiques et 1 μg/ml de trypsine TPCK (Sigma, T-1426).
Des stocks de 1,8 % de Bacto-Agar (BD, 214010) et de 2 % de méthylcellulose (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s à 2 %, Fluka) dans de l’eau distillée ont été préparés comme décrit précédemment .
Le fabricant d’Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) a aimablement fourni trois types d’Avicel (RC-581, RC-591 et CL-661) pour les tests. Nous avons préparé des suspensions d’Avicel en dispersant 2,4 g de poudre d’Avicel dans 100 ml d’eau distillée sur un agitateur magnétique standard pendant 1 heure. Les stocks de gélose, de MC et d’Avicel ont été stérilisés par autoclavage pendant 20 min à 121°C et stockés à température ambiante.
Les overlays ont été préparés en mélangeant des solutions mères de MC, d’Avicel ou de gélose fondue avec des volumes égaux de milieu d’entretien double force. Pour faire varier la concentration de MC et d’Avicel dans les overlays, nous avons dilué les stocks originaux avec de l’eau stérile. Le recouvrement en gélose a été préparé à 42-44°C, deux autres recouvrements ont été préparés à 20 ou 37°C.
Les stocks d’Avicel concentrés (2,4%) ne se sont généralement pas séparés pendant le stockage, les recouvrements à base d’Avicel dilués étaient cependant moins stables. Si nous l’avons jugé nécessaire, nous avons mélangé les stocks d’Avicel, et nous avons toujours mélangé les overlays d’Avicel avant de les utiliser, soit en les secouant avec la main, soit en les mélangeant au vortex. La séparation lente des overlays après leur application sur les monocouches cellulaires n’a pas affecté les résultats du test.
Dosage des plaques dans des plaques 6 puits
Une heure après avoir infecté les monocouches cellulaires avec 30-50 unités formatrices de plaques du virus dans 1 ml de milieu d’entretien sans trypsine, nous avons retiré l’inoculum de virus, recouvert les cellules avec 3 ml des différents milieux d’overlays et incubé les cultures à 35°C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Dans le cas des milieux de recouvrement MC et Avicel, nous avons pris soin de ne pas perturber les plaques pendant la période d’incubation afin d’éviter la formation de plaques non uniformes. Après trois jours d’incubation, nous avons retiré les overlays et fixé les cellules. La surcouche de gélose a été retirée à l’aide d’une spatule métallique ; les surcouches de MC, Avicel et liquide ont été retirées par aspiration. Les cellules ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % dans MEM pendant 30 minutes à 4°C et lavées avec du PBS. Tous les traitements ultérieurs des cellules ont été effectués à température ambiante. Nous avons perméabilisé les cellules et bloqué simultanément les groupes aldéhyde résiduels en incubant les cellules pendant 10-20 min avec 1 ml/puits de solution contenant 0,5 % de Triton-X-100 et 20 mM de glycine dans du PBS. Nous avons immunocoloré les cellules infectées par le virus en les incubant pendant 1 h avec des anticorps monoclonaux spécifiques de la nucléoprotéine du virus de la grippe A (aimablement fournis par le Dr Alexander Klimov des Centers for Disease Control, États-Unis), puis en les incubant pendant 1 h avec des anticorps anti-souris marqués à la peroxydase (DAKO, Danemark) et en les incubant pendant 30 min avec des substrats de peroxydase formant un précipité. Une solution de sérum de cheval normal à 10% et de Tween-80 à 0,05% dans du PBS a été utilisée pour la préparation des dilutions de travail des immuno-réactifs. Nous avons lavé les cellules après l’application des anticorps primaires et secondaires en les incubant trois fois pendant 3-5 min avec du Tween-80 à 0,05% dans du PBS. Comme substrats de peroxydase, nous avons utilisé soit le True Blue™ (KPL) prêt à l’emploi, soit une solution d’aminoéthylcarbazole (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) préparée dans un tampon acétate de sodium 0,05 M, pH 5,5 et contenant 0,03% de H2O2. Les plaques colorées ont été lavées à l’eau du robinet pour arrêter la réaction et séchées. Dans le cas de la coloration True Blue, qui est relativement instable dans les solutions aqueuses, les plaques ont été séchées à l’envers afin de minimiser le blanchiment. Les plaques colorées ont été scannées sur un scanner à plat et les données ont été acquises par le logiciel Adobe Photoshop 7.0.
Comme alternative à l’immunocoloration, dans certaines expériences, nous avons révélé les plaques comme des zones de cellules détruites. A cette fin, après avoir retiré les superpositions, nous avons coloré les cellules avec une solution de cristal violet à 1% dans 20% de méthanol dans l’eau.
Variantes du titrage du virus dans des plaques à 96 puits
1. Variante standard
Nous avons infecté des monocouches de cellules MDCK ou MDCK-SIAT1 dans des plaques 96 puits avec 50 μl/puits de dilutions sérielles du virus dans le milieu d’entretien sans trypsine. Après 1 h d’incubation à 35°C dans 5% de CO2, nous avons retiré le virus, ajouté 100 μl/puits de milieu de superposition MC ou Avicel, et incubé les cellules pendant 24 h supplémentaires pour permettre la formation de plaques. La fixation et l’immunocoloration ont été réalisées comme décrit ci-dessus pour les plaques à 6 puits mais en utilisant 50 μl de réactifs par puits.
2. Variante simplifiée
Le test a été réalisé exactement comme dans la variante standard avec les modifications suivantes. Après 1 h d’incubation avec le virus, nous n’avons pas retiré l’inoculum. Nous avons ajouté 100 μl/puits de milieu de recouvrement Avicel et mélangé la plaque soit en tapant avec la main, soit en utilisant un mélangeur de plaque. Le milieu comprenait des quantités accrues de trypsine (1,5 μg/ml) pour compenser la dilution du recouvrement avec le matériel contenant le virus présent dans les puits.
Test d’inhibition de la plaque
Noel Roberts (Roche Products, UK) a aimablement fourni l’inhibiteur de la neuraminidase, le carboxylate d’oseltamivir (OC). Nous avons ajouté 50 μl/puits de dilutions sérielles décuplées d’OC dans le milieu de maintenance sans trypsine (plage de concentration de 4 nM à 400 μM d’OC) à des monocouches de cellules MDCK-SIAT1 dans des plaques à 96 puits. Nous avons ensuite ajouté 50 μl/puits de dilutions virales (20-40 unités formatrices de plaques par puits). Nous avons mélangé la plaque et l’avons incubée pendant 1 h à 35°C pour permettre l’initiation de l’infection virale. Après cela, nous avons ajouté 100 μl/puits de milieu de recouvrement Avicel à 1,2 % contenant 2 μg/ml de trypsine, nous avons incubé les cultures pendant 24 h et nous les avons fixées et immunocolorées comme décrit ci-dessus.
Dans le cas des plaques à 6 puits, nous avons ajouté 0,75 ml d’aliquotes du médicament et de l’inhibiteur et 1,5 ml d’aliquote d’Avicel par puits et nous avons immunocoloré les plaques 3 jours après l’infection.