Protéines fluorescentes de A. victoria
Les propriétés spectrales de la GFP ou de ses variantes résident dans la structure des acides aminés formant le chromophore (figure 1). Il peut s’agir des trois acides aminés en positions 65-67 ou de résidus proches de cet emplacement (par exemple YFP). Outre les principales mutations concernant le chromophore, des recherches ont également été menées sur d’autres mutagenèses dirigées par site afin d’améliorer d’autres facteurs comme la maturation et l’expression des protéines dans des systèmes cellulaires hétérologues (par exemple l’utilisation des codons, le repliement des protéines à température physiologique). Notez que A. victoria est un organisme marin relativement primitif qui ne possède pas de système de chaleur corporelle.
Même si la GFP est l’une des FP les plus populaires en raison de sa luminosité et de sa grande photostabilité, elle présente deux inconvénients majeurs. Il s’agit d’une certaine sensibilité au pH et d’une légère tendance à se dimériser. La dimérisation ou l’oligomérisation est un problème de nombreux FP. Leur préférence à s’agglutiner les unes aux autres peut produire des artefacts ou des erreurs d’interprétation concernant la localisation et la fonction de la protéine fusionnée. Mais les scientifiques ont trouvé des réponses à ce problème également. Des mutations à des positions critiques (F223R, L221K et A206K) où les acides aminés non polaires sont remplacés par des acides aminés hydrophiles montrent une dimérisation réduite. Toutes les modifications génétiques qui conduisent à une amélioration des caractéristiques spectrales mais aussi pratiques sont résumées sous le nom de FP « améliorées ».
Dans le cas de la wtGFP, les améliorations conduisent à une EGFP (enhanced GFP) avec un seul pic d’excitation à 488 nm au lieu du spectre d’absorption complexe précédent à 395 nm et 475 nm. La première version mutée de la wtGFP (le mutant S65T) développée par Roger Tsien et al. était cinq fois plus brillante que l’originale et présentait un temps de maturation plus court. Avec une meilleure efficacité de maturation à 37°C, basée sur une autre mutation (F64L), cela joue un rôle important pour les personnes qui regardent des cellules vivantes.
Une variante de GFP très intéressante avec l’un des plus grands décalages de Stokes est Sapphire. Une mutation à une position proche du chromophore (T203I) conduit à une altération du maximum d’excitation à 399 nm et du maximum d’émission à 511 nm. Il s’agit d’un décalage de Stokes de 112 nm. Emerald est une autre modification de la GFP avec une photostabilité et une luminosité améliorées et un repliement plus efficace dans les cellules de mammifères.
Alors que toutes les protéines fluorescentes vertes ont une luminosité relativement élevée, les protéines fluorescentes bleues souffrent normalement d’une intensité d’émission réduite dans les applications microscopiques. Néanmoins, elles sont utilisées dans les tests optiques en raison d’autres propriétés spectrales. La protéine EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) a été construite par plusieurs séries de mutations de la wtGFP. La première mutation (Y66H) a fait sauter le pic d’émission du spectre vert au spectre bleu. D’autres mutations ont suivi, produisant une protéine avec un maximum d’excitation à 380 nm et un maximum d’émission à 448 nm. Ces propriétés spectrales en font un partenaire de l’EGFP en microscopie FRET. Les protéines fluorescentes bleues récentes présentant des rendements quantiques plus élevés et une meilleure photostabilité sont Azurite, SBFP2 et EBFP2. Un successeur prometteur de l’EBFP est une protéine nommée Sirius qui est devenue populaire en raison de sa très haute tolérance au pH (stable de pH 3-9) et de sa réputation de protéine fluorescente ayant la plus courte longueur d’onde d’émission à ce jour.
Une deuxième classe « bleue » de variantes de GFP est formée par les protéines fluorescentes cyan : CFP. La substitution de la tyrosine par le tryptophane (Y66W) et d’autres altérations génétiques conduisent à un fluorochrome dont la luminosité et la photostabilité sont améliorées. Cette ECFP a un spectre d’excitation et d’émission bimodal à 433/445 nm et 475/503 nm. La luminosité ne représente qu’environ 40 % de celle de l’EGFP. Une variante importante de l’ECFP est Cerulean, qui a un coefficient d’extinction et un rendement quantique plus élevés. Il est 1,5 fois plus brillant que l’ECFP et est utilisé comme partenaire FRET avec l’YFP.
Une mutation de la GFP ne modifiant pas directement l’un des trois acides aminés centraux du chromophore a entraîné l’essor des protéines fluorescentes jaunes. Les YFP ont une thréonine commune en position 203 qui est échangée par une tyrosine (T203Y). Cet acide aminé fait partie du β-barrel et se trouve à proximité du chromophore. Par rapport à la GFP, les propriétés d’excitation et d’émission ont été déplacées vers des longueurs d’onde plus grandes avec des maxima d’excitation et d’émission à 514 nm et 527 nm (EYFP). L’une des caractéristiques de l’EYFP est sa sensibilité au pH. À pH 6,5, l’EYFP ne présente qu’environ 50 % de sa fluorescence, ce qui n’est pas toujours un inconvénient. Lorsqu’il s’agit de mesurer le pH (par exemple des vésicules, des endosomes, etc.), l’EYFP peut être utilisée comme indicateur. Il est intéressant de noter qu’une autre mutation (Q69M) a permis de développer une meilleure stabilité acide et d’améliorer considérablement la luminosité (75 % plus lumineuse que l’EGFP). Cette protéine, qui présente toujours une faible photostabilité par rapport à l’EGFP, a été appelée Citrine. Un autre mutant YFP (F46L) a montré une vitesse de maturation nettement plus rapide et une meilleure résistance au pH. Cette protéine a été nommée Venus et est un accepteur FRET fréquent avec Cerulean.