Séquençage 16S vs séquençage métagénomique Shotgun

Quoi choisir pour les études sur le microbiome

Séquençage 16S ou séquençage shotgun ? Presque tous les chercheurs en microbiome se posent cette question lorsqu’ils planifient une nouvelle étude, car la grande majorité des publications sur le microbiome utilisent soit le séquençage du gène de l’ARNr 16S, soit le séquençage métagénomique shotgun pour générer des données brutes en vue d’analyses ultérieures de profilage microbien ou de métagénomique. Chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients, alors, quelle méthode choisir ?

Qu’est-ce que le séquençage du gène de l’ARNr 16S ?

Le séquençage du gène de l’ARNr 16S, ou simplement le séquençage 16S, utilise la PCR pour cibler et amplifier des portions des régions hypervariables (V1-V9) du gène de l’ARNr 16S bactérien1. Les amplicons provenant d’échantillons distincts reçoivent ensuite des codes-barres moléculaires, sont regroupés et séquencés. Après le séquençage, les données brutes sont analysées à l’aide d’un pipeline bioinformatique qui comprend l’élagage, la correction des erreurs et la comparaison avec une base de données de référence 16S. Une fois les lectures assignées à un rang phylogénétique, un profil taxonomique peut être généré. De même, le séquençage ITS suit la même stratégie mais en ciblant la région ITS (Internal transcribed spacer) présente dans les génomes fongiques.

Qu’est-ce que le séquençage métagénomique shotgun ?

Contrairement au séquençage 16S, qui cible uniquement les gènes de l’ARNr 16S, le séquençage métagénomique shotgun séquence tout l’ADN génomique donné d’un échantillon. Le flux de travail de préparation de la bibliothèque est similaire au séquençage régulier du génome entier, y compris la fragmentation aléatoire et la ligature des adaptateurs. Un flux de travail typique pour l’analyse taxonomique des données métagénomiques shotgun comprend l’élagage de la qualité et la comparaison avec une base de données de référence comprenant des génomes entiers (par exemple Kraken2 et Centrifuge3) ou des gènes marqueurs sélectionnés (MetaPhlAn4 et mOTU5) pour générer un profil taxonomique. Comme le séquençage métagénomique shotgun couvre toute l’information génétique d’un échantillon, les données peuvent être utilisées pour des analyses supplémentaires, par exemple l’assemblage et le classement métagénomique, le profilage des fonctions métaboliques et le profilage des gènes de résistance aux antibiotiques.

Séquençage 16S/ITS vs. Séquençage métagénomique shotgun

Si votre étude nécessite des analyses génomiques au-delà du profilage taxonomique, comme l’analyse des voies métaboliques, vous devriez envisager le séquençage métagénomique shotgun en raison de sa plus grande couverture génomique et de sa production de données. Si le profilage de la composition est l’objectif principal de l’étude, les deux techniques ont des avantages et des inconvénients à prendre en compte (tableau 1).

Résolution taxonomique

La résolution taxonomique du séquençage 16S/ITS dépend des régions variables ciblées, de l’organisme lui-même et de l’algorithme d’analyse de la séquence. Ces dernières années, certaines méthodes de correction d’erreurs, par exemple DADA26, ont considérablement amélioré la précision et la résolution taxonomique de cette technique. Avec DADA2, la résolution au niveau de l’espèce pour de nombreux organismes utilisant le séquençage 16S ordinaire est maintenant une réalité. Mais en théorie, le séquençage métagénomique shotgun peut atteindre une résolution au niveau de la souche car il peut couvrir toutes les variations génétiques. Bien qu’en pratique, la précision de la résolution au niveau de la souche se heurte encore à des difficultés techniques. Même ainsi, le séquençage métagénomique shotgun atteint une résolution plus élevée par rapport au séquençage 16S/ITS.

Profilage fonctionnel

Si l’analyse de la fonction métabolique est un objectif, la plupart des chercheurs vont rapidement négliger le séquençage 16S et ITS. Mais, il existe certains outils permettant de déduire la fonction métabolique à partir des données taxonomiques, par exemple PICRUSt7. Mais, en général, le séquençage métagénomique shotgun est souvent utilisé lorsque le profilage fonctionnel est requis en raison de la couverture supplémentaire des gènes.

Couverture microbienne et type d’échantillon recommandé

Le séquençage shotgun examine tout l’ADN métagénomique alors que le séquençage 16S ne porte que sur les gènes de l’ARNr 16S, qui souffre également d’une couverture incomplète des amorces. Par conséquent, le premier a une plus grande couverture inter-domaines. Alors, pourquoi le tableau 1 indique-t-il que le séquençage 16S/ITS est meilleur pour la couverture des bactéries et des champignons ? Cela provient de la couverture des espèces des bases de données de référence disponibles, car la prédiction de la taxonomie de ces approches de séquençage dépend fortement de la base de données de référence utilisée. Actuellement, la couverture des bases de données 16S/ITS est bien meilleure que celle des bases de données du génome entier. Cela est dû au fait que les génomes entiers des microbes associés au microbiome humain sont beaucoup mieux étudiés que les génomes des microbes associés à d’autres environnements. C’est pourquoi il est recommandé d’utiliser le séquençage métagénomique shotgun pour les échantillons liés au microbiome humain, tels que les fèces et la salive, si le profilage de la taxonomie est l’objectif principal.

De plus, le séquençage métagénomique a une plus grande dépendance à la base de données de référence. Par exemple, si une bactérie n’a pas de représentant étroitement apparenté dans la base de données de référence 16S, vous pourriez être en mesure de l’identifier à un rang phylogénétique supérieur ou comme une bactérie inconnue. Mais, dans le cas du séquençage métagénomique shotgun, si une bactérie n’a pas de parent proche (un génome du même genre) dans la base de données de génome de référence, vous risquez de la manquer complètement. Par exemple, le Spike-in Control I de ZymoBIOMICS contient deux microbes étrangers au microbiome humain (Imtechella halotolerans et Allobacillus halotolerans), dont les génomes n’étaient pas disponibles auparavant. Si vous les introduisez dans un échantillon fécal et les séquencez avec le séquençage shotgun, la plupart des pipelines bioinformatiques les manqueront complètement, à moins que vous n’ajoutiez manuellement ces deux génomes dans la base de données de référence. En revanche, s’ils sont analysés avec le séquençage 16S, ils seront identifiés en raison de la présence de leur séquence 16S dans les bases de données de référence.

Faux positifs

Les outils de correction des erreurs, tels que DADA2, améliorent non seulement la résolution taxonomique du séquençage 16S/ITS, mais aussi la précision. Cela est démontré lors du séquençage de l’ADN de la communauté microbienne fictive (par exemple, ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Toutes les séquences 16S sont récupérées sans erreur dans la séquence, c’est-à-dire sans faux positifs. Mais, avec le séquençage métagénomique shotgun, à moins qu’il n’existe un génome représentatif parfait dans la base de données de référence pour un microbe séquencé, l’analyse bioinformatique est susceptible de prédire l’existence de plusieurs génomes « étroitement liés ». Ces génomes étroitement apparentés peuvent provenir de différentes espèces du même genre ou même de genres différents. Par exemple, supposons qu’il existe trois microbes étroitement apparentés, A, B et C, et qu’ils partagent certaines séquences en commun. L’espèce A ne partage certaines séquences qu’avec B et d’autres séquences qu’avec C. Si la base de données de référence ne contient que les génomes de B et C, lorsque A a été séquencé, la bioinformatique prédit que B et C sont présents. Par exemple, A et B pourraient être des souches d’Escherichia coli et C des Salmonella enterica ; les séquences partagées uniquement par B et C peuvent provenir d’un transfert horizontal de gènes, qui est courant entre des microbes étroitement apparentés. Pour cette raison, le séquençage 16S/ITS est meilleur en ce qui concerne les faux positifs.

Interférence de l’ADN hôte

La présence d’une trop grande quantité d’ADN hôte peut provoquer une amplification non spécifique dans le processus de préparation de la bibliothèque du séquençage 16S et ITS, mais l’impact est contrôlable en ajustant les cycles PCR et en changeant les amorces. En revanche, l’interférence de l’ADN hôte est un problème beaucoup plus difficile pour le séquençage métagénomique shotgun, même si le coût du séquençage a considérablement diminué. Selon le type d’échantillon, certains échantillons peuvent contenir >99% d’ADN hôte humain, ce qui non seulement augmente le coût du séquençage mais introduit également une incertitude dans la mesure. C’est pourquoi de nombreux chercheurs envisagent l’épuisement de l’ADN hôte, par exemple avec le kit d’ADN microbien HostZERO, avant la préparation de la bibliothèque de séquençage shotgun. Cependant, il se peut qu’il ne reste pas assez d’ADN génomique microbien pour le séquençage shotgun après l’épuisement de l’ADN hôte, qui nécessite généralement un apport minimum de 1ng. L’interférence de l’ADN de l’hôte est la raison pour laquelle le séquençage shotgun peu profond n’est recommandé que pour les échantillons fécaux humains.

Entrée d’ADN

Alors que le séquençage métagénomique Shotgun nécessite une entrée d’ADN de 1 ng au minimum, le séquençage 16S/ITS est beaucoup plus sensible, les minima d’entrée étant des femtogrammes ou même aussi bas que 10 copies de gènes d’ARNr 16S.

Here to Help

Le choix entre le séquençage 16S et le séquençage métagénomique shotgun est une étape critique pour toutes les études sur le microbiome. Outre le budget, de nombreux aspects du projet doivent être pris en compte, notamment le type d’échantillon, les analyses souhaitées, la résolution taxonomique et les organismes cibles. La prise en compte de ces éléments vous aidera à choisir la bonne méthode de séquençage pour votre prochain projet sur le microbiome. Les services de séquençage du microbiome de ZymoBIOMICS proposent le séquençage 16S, ITS et shotgun comme services complets, de l’extraction de l’ADN au séquençage et à la bioinformatique. Les experts en séquençage et en bioinformatique de Zymo Research sont heureux de vous aider à choisir la bonne méthode de séquençage pour votre étude.

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13 novembre 2019