Roth fait ses débuts d’acteur à l’âge de 21 ans, en jouant un skinhead suprémaciste blanc nommé Trevor dans le téléfilm Made in Britain. Il joue un personnage de l’East End dans King of the Ghetto, un drame controversé basé sur un roman de Farukh Dhondy se déroulant à Brick Lane et diffusé par la BBC en 1986. Il a joué un jeune homme timide dans le film Meantime de Mike Leigh en 1984.
En 1985, il est apparu dans le téléfilm Murder with Mirrors. Il joue le rôle d’un apprenti tueur à gages dans The Hit de Stephen Frears, ce qui lui vaut l’Evening Standard Award du nouveau venu le plus prometteur. En 1989, il tient un second rôle dans le rôle du laquais bouffon Mitchell dans le film de Peter Greenaway, The Cook, the Thief, His Wife & Her Lover. En 1990, il joue le rôle de Vincent van Gogh dans Vincent & de Robert Altman et Guildenstern dans Rosencrantz & Guildenstern Are Dead de Tom Stoppard.
Roth et d’autres jeunes acteurs britanniques de la fin des années 1980, comme Gary Oldman, Colin Firth, Daniel Day-Lewis, Bruce Payne et Paul McGann, ont été surnommés le Brit Pack. Roth joue le rôle de « Mr. Orange » dans le film Reservoir Dogs de Quentin Tarantino en 1992. En 1994, Tarantino lui confie le rôle d’un voleur dans Pulp Fiction. Ils ont également collaboré dans le film Four Rooms de 1995, où il jouait le rôle de Ted. Son rôle d’Archibald Cunningham dans Rob Roy lui vaut le BAFTA Award du meilleur acteur dans un second rôle, ainsi qu’une nomination à l’Academy Award du meilleur acteur dans un second rôle, et une nomination au Golden Globe.
En 1996, il joue dans la comédie musicale Tout le monde dit que je t’aime de Woody Allen. Il a également joué le rôle de « Danny Boodman T.D. Lemon 1900 » dans La Légende de 1900, et la même année, il a joué dans le film Gridlock’d. Il a fait ses débuts de réalisateur en 1999 avec The War Zone, une version cinématographique du roman d’Alexander Stuart. En 2001, il a joué le rôle du général Thade dans La Planète des singes de Tim Burton. Roth était le choix initial pour le rôle de Severus Rogue dans la série de films Harry Potter, mais il a refusé pour La Planète des singes.
Il a été envisagé pour le rôle d’Hannibal Lecter dans le film Hannibal en 2001 avant qu’Anthony Hopkins ne revienne récupérer le rôle. Il est apparu dans Jeunesse sans jeunesse de Francis Ford Coppola et dans Funny Games de Michael Haneke, puis a joué le rôle d’Emil Blonsky / Abomination, un officier d’origine russe dans les commandos des Royal Marines du Royaume-Uni, dans L’Incroyable Hulk. Le réalisateur de Hulk, Louis Leterrier, était un fan du travail de Roth, le réalisateur ayant déclaré au magazine Empire : « c’est génial de voir un garçon normal de Cockney devenir un super-héros ! ».
De 2009 à 2011, il a joué dans Lie To Me dans le rôle de Cal Lightman, un expert du langage corporel qui aide les organisations de la loi locale et fédérale dans les enquêtes sur les crimes. Fan des Monty Python depuis sa jeunesse, il est apparu en 2009 dans le documentaire télévisé Monty Python : Almost the Truth (Lawyers Cut). En 2010, Roth est apparu sur la couverture de l’album studio 2010 de Manic Street Preachers, Postcards from a Young Man.
En 2012, il a été annoncé comme le président du jury de la section Un certain regard au Festival de Cannes 2012. Il a joué le rôle du président de la FIFA, Sepp Blatter, dans United Passions, un film sur l’instance dirigeante du football, sorti en 2014, pour coïncider avec le 110e anniversaire de la FIFA, et la Coupe du monde de football 2014. En 2015, il a joué dans le film Chronic qui a bénéficié d’une sortie limitée en 2016. Il a ensuite reçu une nomination à l’Independent Spirit Award du meilleur premier rôle masculin. Roth a retrouvé Tarantino dans The Hateful Eight (2015), où il joue le rôle d’Oswaldo Mobray/English Pete Hicox. En 2019, Roth devait apparaître dans Once Upon a Time in Hollywood de Tarantino, mais ses scènes ont été coupées. Il devrait reprendre son rôle d’Emil Blonsky / Abomination dans la prochaine série Disney+ She-Hulk, qui se déroule dans le Marvel Cinematic Universe.