Voies d’apoptose extrinsèque versus intrinsèque en chimiothérapie anticancéreuse

Signalisation par la voie intrinsèque de l’apoptose

Dans la voie mitochondriale de l’apoptose, l’activation des caspases est étroitement liée à la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe par les membres proapoptotiques de la famille Bcl (Green et Kroemer, 2004). De nombreux stimuli cytotoxiques et molécules transductrices de signaux proapoptotiques convergent vers les mitochondries pour induire la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (Decaudin et al., 1998 ; Green et Kroemer, 2004). Cette perméabilisation est régulée par des protéines de la famille Bcl-2, des lipides mitochondriaux, des protéines qui régulent le flux de métabolites bioénergétiques et des composants du pore de transition de perméabilité (Green et Kroemer, 2004). Lors de la rupture de la membrane mitochondriale externe, un ensemble de protéines normalement présentes dans l’espace entre les membranes mitochondriales interne et externe est libéré, notamment le cytochrome c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF et l’endonucléase G (Saelens et al., 2004). Une fois dans le cytosol, ces protéines apoptogènes déclenchent l’exécution de la mort cellulaire en favorisant l’activation des caspases ou en agissant comme effecteurs de mort indépendants des caspases (Saelens et al…, 2004).

Médiateurs mitochondriaux de l’apoptose dépendante des caspases

Cytochrome c

La libération du cytochrome c par les mitochondries déclenche directement l’activation de la caspase-3 par la formation du complexe apoptosome contenant le cytochrome c/Apaf-1/caspase-9 (Cain et al., 2000). Une fois dans le cytosol, le cytochrome c se lie à la région C-terminale de l’Apaf-1, une protéine cytosolique avec un domaine N-terminal de recrutement des caspases (CARD), un domaine de liaison aux nucléotides présentant une homologie avec le CED-4 de Caenorhabditis elegans et un domaine C-terminal contenant 12-13 répétitions WD-40 (Zou et al., 1997). La liaison du cytochrome c à l’Apaf-1 facilite l’association du dATP avec l’Apaf-1 et expose son CARD N-terminal, qui peut maintenant s’oligomériser et devenir une plateforme sur laquelle la caspase-9 initiatrice est recrutée et activée par une interaction CARD-CARD (Adrain et al., 1999). Par la suite, l’exécuteur caspase-3 est recruté dans l’apoptosome, où il est activé par la caspase-9 résidente (Bratton et al., 2001). La caspase-3 clive ensuite des substrats clés dans la cellule pour produire un grand nombre des événements cellulaires et biochimiques de l’apoptose.

Dans certains cas, l’activité caspase déclenchée par le cytochrome c cytosolique contribue à la chute de la métalloprotéinase matricielle (MMP), comme l’a montré l’utilisation d’inhibiteurs synthétiques de la caspase et de cellules Apaf1 -/- (Waterhouse et al., 2001). En outre, l’activité des caspases endommage davantage la fonction des mitochondries perméabilisées en affectant l’activité des complexes I et II, ce qui conduit inévitablement à la perte de MMP et à la génération d’espèces réactives de l’oxygène (Ricci et al., 2004). Ainsi, les événements secondaires résultant des changements cytosoliques, causés par la libération de cytochrome c et d’autres protéines IMS mitochondriales, peuvent rétroagir sur les mitochondries perméabilisées et affecter leur fonction. Il est important de noter que cette boucle d’amplification mitochondriale de l’activité des caspases peut déterminer de manière critique la réponse des cellules cancéreuses aux traitements cytotoxiques.

En outre, il existe des preuves récentes de l’existence d’un ou plusieurs mécanismes d’activation des caspases indépendants du cytochrome c et de l’apoptosome, mais dépendants de l’Apaf-1. Un knock-in ciblé d’une variante du cytochrome c dépourvue de propriétés apoptogènes, mais possédant une activité de transfert d’électrons et une activité antioxydante (K72A), a permis d’évaluer la contribution du cytochrome c à l’apoptose sans affecter sa fonction dans la phosphorylation oxydative (Hao et al., 2005). Il est intéressant de noter que les thymocytes des souris KA/KA étaient nettement plus sensibles aux stimuli de mort, y compris l’étoposide et l’irradiation γ, que les thymocytes Apaf-1(-/-) (Hao et al., 2005). Lors du traitement par γ-irradiation, les procaspases ont été efficacement activées dans les thymocytes apoptotiques KA/KA, mais l’oligomérisation d’Apaf-1 n’a pas été observée (Hao et al., 2005), 2005) indiquant une exigence différentielle pour le cytochrome c et Apaf-1 dans l’apoptose.

Smac/DIABLO

D’autres protéines libérées par les mitochondries, telles que Smac/DIABLO et Omi/HtrA2, facilitent l’activation des caspases en neutralisant les inhibiteurs endogènes des caspases, les protéines inhibitrices de l’apoptose (IAP). Smac et son homologue murin DIABLO sont des protéines mitochondriales codées par le noyau, qui contiennent un signal de localisation mitochondriale, lequel est éliminé par protéolyse lors de l’importation mitochondriale pour donner la protéine mature de 23 kDa (Du et al., 2000 ; Verhagen et al., 2000). Cette étape de maturation expose le motif de liaison IAP (IBM) à l’extrémité N-terminale de Smac/DIABLO (Du et al., 2000) (Tableau 1). Il a été démontré que le second activateur de caspase dérivé des mitochondries/DIABLO se lie à XIAP, cIAP1, cIAP2, survivine et Apollon de manière BIR-dépendante (Vaux et Silke, 2003) (Figure 2), et agit en tant qu’homodimère avec l’IBM présent dans une configuration bivalente (Chai et al., 2000). Un dimère Smac/DIABLO lie une molécule XIAP par les deux motifs de liaison IAP, l’un interagissant avec BIR2 et l’autre avec BIR3 (Huang et al., 2003). De façon intrigante, le même sillon de BIR3 se lie à l’IBM exposé à l’extrémité N-terminale (Ala-Thr-Pro-Phe) de la petite sous-unité de la caspase-9 après sa transformation autocatalytique après Asp315, permettant à Smac/DIABLO de déplacer la caspase-9 de XIAP (Srinivasula et al., 2001) (Tableau 1).

La fonction mitochondriale physiologique de Smac/DIABLO est inconnue, et les souris DIABLO -/- semblent normales (Okada et al., 2002). Bien que le clivage in vitro de la procaspase-3 après ajout de cytochrome c ait été inhibé dans les lysats de cellules Smac -/-, les souris et les cellules Smac -/- ont répondu normalement aux stimuli apoptotiques tels que l’irradiation UV, la staurosporine, l’étoposide et le TNF/cyclohexamide (Okada et al., 2002). Ces observations suggèrent l’existence de facteurs redondants compensant la perte de Smac/DIABLO, peut-être HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 est une protéine de 49 kDa codée par le noyau avec un signal de localisation mitochondriale N-terminal qui médiatise sa translocation dans l’espace intermembranaire mitochondrial (Suzuki et al., 2001 ; Martins et al., 2002 ; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 est transformé dans l’espace intermembranaire en la forme mature de 37 kDa, libérant un IBM à son extrémité N-terminale (Suzuki et al., 2001 ; Martins et al., 2002 ; van Loo et al., 2002) (Tableau 1). Bien que l’Omi/HtrA2 recombinante puisse catalyser sa propre maturation in vitro, la protéase responsable de sa maturation dans les cellules reste inconnue (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 joue un rôle essentiel dans la régulation de l’homéostasie mitochondriale nécessitant son activité protéolytique, bien que les cibles moléculaires et les partenaires d’interaction d’Omi/HtrA2 dans la mitochondrie n’aient pas encore été définis (Saelens et al., 2004). Une fois que l’Omi/HtrA2 est libérée des mitochondries dans le cytosol, elle favorise la mort cellulaire d’une manière dépendante des caspases en antagonisant les IAP, et d’une manière indépendante des caspases en tant que protéase (Saelens et al., 2004). Comme Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 bloque les IAPs grâce à son motif de liaison IAP N-terminal, présenté dans une configuration trimérique (Li et al, 2002)

Bien que la libération du cytochrome c dans le cytosol déclenche directement l’activation de la caspase-3 par la formation du complexe apoptosome contenant le cytochrome c/Apaf-1/caspase-9, Smac/DIABLO et Omi/HtrA2 favorisent indirectement l’activation des caspases en antagonisant les effets inhibiteurs des IAPs (Saelens et al., 2004). Il existe donc un équilibre dynamique entre les molécules effectrices pro- et antiapoptotiques, qui permet à la cellule de faire face à des dommages mitochondriaux limités, auquel cas les IAP peuvent bloquer de manière adéquate l’activation des caspases initiée par une petite quantité de cytochrome c libéré. Cependant, dans des circonstances où les dommages mitochondriaux se poursuivent ou affectent simultanément plusieurs mitochondries, l’obstacle antiapoptotique imposé par les IAP peut être surmonté par la concentration cytosolique plus élevée de leurs antagonistes Smac/DIABLO et HtrA2/OMI, qui neutralisent les IAP par liaison directe.

Il y a de plus en plus de preuves que les cellules cancéreuses ont une pulsion intrinsèque à l’apoptose qui est tenue en échec par les IAP. À cette fin, des niveaux basaux élevés d’activités de la caspase-3 et de la caspase-8 et des fragments de caspase-3 actifs en l’absence d’apoptose ont été détectés dans diverses lignées cellulaires tumorales et dans des tissus cancéreux, mais pas dans des cellules normales (Yang et al., 2003a). Les cellules tumorales, mais pas les cellules normales, ont également exprimé des niveaux élevés d’IAPs, ce qui suggère que l’expression régulée des IAPs contrecarre l’activité basale élevée des caspases de manière sélective dans les cellules tumorales (Yang et al., 2003a). Par conséquent, les stratégies ciblant les IAP sont considérées comme une approche prometteuse pour améliorer l’efficacité des thérapies cytotoxiques de manière sélective dans les cellules cancéreuses. À cette fin, l’expression de Smac/DIABLO renforcée par transfection a abaissé le seuil de destruction induite par TRAIL dans différentes tumeurs (Ng et Bonavida, 2002 ; Okano et al., 2003) et a également sensibilisé les cellules cancéreuses à la chimiothérapie (McNeish et al., 2003 ; Zhao et al., 2006). Cependant, la translocation de Smac/DIABLO endogène dans le cytosol au cours de l’apoptose induite par les médicaments anticancéreux ne semble pas jouer un rôle majeur dans certaines conditions, par exemple dans les cellules de carcinome pulmonaire humain après traitement à l’étoposide (Bartling et al., 2004). La régulation négative de Smac/DIABLO par un petit ARN interférent (siRNA) n’a pas influencé la destruction par l’étoposide dans ces cellules, bien qu’un peptide Smac-N7 se liant à IAP ait augmenté l’apoptose induite par l’étoposide (Bartling et al., 2004). Ces données suggèrent que la déficience de Smac/DIABLO peut être compensée par l’action de déterminants redondants dans certaines cellules cancéreuses.

Médiateurs mitochondriaux de l’apoptose indépendante de la caspase

Sur sa libération de l’espace intermembranaire mitochondrial, HtrA2/OMI contribue à la mort cellulaire également de manière indépendante de la caspase en tant que protéase en plus de promouvoir l’apoptose de manière dépendante de la caspase en antagonisant les IAPs (Suzuki et al, 2001 ; Martins et al., 2002 ; van Loo et al., 2002). Des données in vitro ont démontré la dégradation de XIAP, cIAP1, cIAP2 et Apollon par l’activité protéase de HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). De plus, Trencia et al. (2004) ont démontré l’interaction de l’antiapoptotique PED/PEA-15 avec, et sa dégradation par, l’HtrA2/OMI cytosolique. La diminution des niveaux de HtrA2/OMI dans les cellules par antisens ou interférence ARN diminue la sensibilité de différentes lignées cellulaires cancéreuses à la mort cellulaire induite par la staurosporine, le Fas, les UV ou le cisplatine (Martins et al, 2002).

De plus, AIF et l’endonucléase G sont libérées des mitochondries lors de la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe et transloquent dans le noyau pour contribuer à la condensation de la chromatine nucléaire et à la fragmentation de l’ADN à grande échelle (Cande et al., 2004 ; Saelens et al., 2004). La question de savoir si ces deux protéines sont libérées avant, en même temps ou après le cytochrome c a fait l’objet de controverses (Arnoult et al., 2002). En outre, on ne sait toujours pas exactement comment l’AIF contribue à la fragmentation de l’ADN nucléaire, car il ne possède pas d’activité DNase intrinsèque. Dans les cellules de mammifères, la cyclophiline A, une peptidyl-prolyl cis-trans isomérase, coopère avec AIF pour induire la dégradation de l’ADN (Cande et al., 2004).

Disruption de la voie intrinsèque dans le cancer

Les mutations des gènes impliqués dans la régulation de la voie mitochondriale sont très fréquentes dans les cellules cancéreuses. Comme la majorité des thérapies anticancéreuses induisent l’apoptose dans les cellules cancéreuses en déclenchant la voie intrinsèque, ces mutations sont généralement associées à une résistance au traitement. Par exemple, la surexpression de Bcl-2, résultant de la translocation chromosomique de l’oncogène bcl-2 dans le locus du gène de la chaîne lourde de l’immunoglobuline, est associée à environ 85 % des lymphomes folliculaires humains (Tsujimoto et al., 1984). Des expériences avec des souris transgéniques ont démontré que la surexpression de Bcl-2 peut favoriser la transformation néoplasique des lymphocytes B et T et des cellules myéloïdes (McDonnell et Korsmeyer, 1991 ; Traver et al., 1998).

Du fait que la surexpression des membres antiapoptotiques de la famille Bcl-2 favorise l’oncogenèse, il s’ensuit que les membres proapoptotiques à domaine BH multiple de cette famille agissent comme suppresseurs de tumeurs. Cependant, étant donné que Bax et Bak ont des rôles largement superposés dans l’apoptose, il a été difficile de déterminer si cette hypothèse se vérifie et, en effet, les souris bax-/- ne sont pas nettement prédisposées à la néoplasie (Knudson et al., 2001). Cependant, des mutations somatiques qui inactivent le gène bax ont été trouvées dans certaines tumeurs solides et hématologiques malignes. A cet effet, des mutations de substitution nucléotidique unique ou de décalage de cadre, qui inactivent le gène Bax dans le cancer du côlon mismatch repair-deficient (MMR) ou dans les hémopathies malignes, ont été décrites (Rampino et al., 1997 ; Kitada et al., 2002).

De plus, il y a de plus en plus de preuves que les protéines BH3-seulement peuvent contribuer à la suppression de la transformation maligne, indiquant qu’elles peuvent fonctionner comme des suppresseurs de tumeurs de bonne foi. Par exemple, il a été démontré que la perte d’un seul allèle de Bim accélérait la lymphomagenèse des cellules B induite par l’expression d’un transgène c-myc (Egle et al., 2004), en accord avec le rôle clé de Bim comme régulateur de l’homéostasie lymphoïde (Strasser, 2005). De manière intéressante, des délétions homozygotes dans la région chromosomique abritant le gène bim ont récemment été identifiées chez des patients atteints de lymphome à cellules du manteau (Tagawa et al., 2005). Les souris dépourvues de bid développent spontanément un trouble myéloprolifératif qui peut évoluer vers une tumeur maligne ressemblant à la leucémie myélomonocytaire chronique (LMCM) (Zinkel et al., 2003). De plus, la suppression de Puma par ARNi a été rapportée comme accélérant la lymphomagenèse induite par Myc (Hemann et al., 2004).

En plus des altérations génétiques, l’expression aberrante des protéines de la famille Bcl-2 est principalement régulée au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel. Par exemple, l’expression de plusieurs protéines antiapoptotiques de la famille Bcl-2, par exemple Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 ou Bfl-1, est régulée transcriptionnellement par NF-κB (Cory et Adams, 2002).

En dehors des protéines de la famille Bcl-2, une activité diminuée ou absente de l’Apaf-1 a été trouvée dans le cancer ovarien, le mélanome et la leucémie. En outre, les mutations du gène suppresseur de tumeur p53, le défaut génétique le plus courant dans les cancers humains, empiètent sur la voie intrinsèque. Par exemple, l’activation de p53 régule à la hausse un certain nombre de gènes possédant des éléments sensibles à p53 présents dans leurs promoteurs, tels que les protéines proapoptotiques BH3-seulement Puma, Noxa et Bid (Oda et al., 2000 ; Yu et al., 2001 ; Sax et al., 2002). Par conséquent, les cellules dans lesquelles p53 est stabilisé sont sensibilisées à l’activation de la voie de mort cellulaire mitochondriale. De plus, p53 peut affecter directement l’intégrité des mitochondries sans qu’il soit nécessaire d’activer un gène. En effet, il a été rapporté que p53 peut se lier à Bcl-2 et Bcl-XL au niveau des mitochondries, favorisant ainsi la déstabilisation mitochondriale (Mihara et al., 2003).

Signalisation par la voie intrinsèque dans le traitement du cancer

La plupart des agents chimiothérapeutiques conventionnels, par exemple l’étoposide, la doxorubicine, le cisplatine ou le paclitaxel, suscitent la perméabilisation mitochondriale de manière indirecte en déclenchant des perturbations du métabolisme intermédiaire ou en augmentant la concentration de seconds messagers proapoptotiques, par exemple, en induisant l’expression de p53, en induisant la voie céramide/GD3, en induisant le système de ligands CD95/CD95L, en affectant les protéines de type Bcl-2 et/ou en compromettant l’équilibre redox ou énergétique.

Il existe de plus en plus de preuves de l’existence d’une diaphonie nucléo-mitochondriale à la suite de dommages à l’ADN. Par exemple, les signaux apoptotiques provenant de dommages à l’ADN peuvent être transmis par le suppresseur de tumeur p53 aux mitochondries, qui à leur tour libèrent des facteurs apoptogènes dans le cytoplasme qui activent les programmes de destruction en aval (Moll et al., 2005). p53 peut indirectement engager la voie mitochondriale en activant transcriptionnellement l’expression des protéines proapoptotiques Bcl-2, par exemple, Bid, Puma ou Noxa (Oda et al., 2000 ; Yu et al., 2001 ; Sax et al., 2002). De plus, p53 peut directement déclencher la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe d’une manière indépendante de la transcription par l’activation directe des protéines Bcl-2 proapoptotiques Bax ou Bak ou par la liaison et l’inactivation des protéines Bcl-2 antiapoptotiques telles que Bcl-2 ou Bcl-XL (Mihara et al., 2003 ; Chipuk et al., 2004 ; Moll et al., 2005). Il est important de noter que la p53 ciblée par les mitochondries a récemment démontré qu’elle possédait des activités de suppression des tumeurs également in vivo (Talos et al., 2005).

De plus, la caspase-2 possède la capacité d’engager la voie apoptotique mitochondriale en réponse aux dommages causés par l’ADN en perméabilisant la membrane mitochondriale externe et/ou en rompant l’association du cytochrome c avec la membrane mitochondriale interne. Par conséquent, les cellules transfectées de façon stable avec un antisens de la procaspase-2, ou exprimant transitoirement un siRNA, étaient réfractaires à la libération du cytochrome c et à divers événements en aval, tels que l’activation des caspases et la fragmentation de l’ADN, induits par les lésions de l’ADN (Lassus et al., 2002 ; Robertson et al., 2002). La caspase-2 peut agir indirectement sur les mitochondries, par exemple en clivant la protéine proapoptotique Bid, suivie de sa translocation vers les mitochondries pour induire la libération de cytochrome c (Guo et al., 2002). De plus, la caspase-2 peut directement perméabiliser la membrane de la mitochondrie externe et stimuler la libération du cytochrome c et de Smac/DIABLO, peut-être en raison de l’interaction directe de la caspase-2 traitée avec des protéines et/ou des phospholipides putatifs situés dans la membrane mitochondriale externe, ou à des sites de contact entre les membranes externe et interne (Robertson et al., 2004). La perméabilisation de la membrane mitochondriale externe nécessite la transformation du zymogène de la caspase-2 mais pas l’activité protéolytique associée et se produit indépendamment de plusieurs protéines de la famille Bcl-2, notamment Bax, Bak et Bcl-2 (Robertson et al., 2004). En outre, il a été démontré que la caspase-2 a la capacité surprenante de rompre l’association entre le cytochrome c et les phospholipides anioniques, notamment la cardiolipine, rendant ainsi le cytochrome c supplémentaire disponible pour être libéré dans le cytosol (Enoksson et al., 2004). Lors d’un dommage à l’ADN, il a été récemment rapporté que la caspase-2 s’active dans ce qu’on appelle le PIDDosome, un complexe de la protéine PIDD, inductible par p53 et contenant un domaine de mort, de la caspase-2 et de la protéine adaptatrice RAIDD (Tinel et Tschopp, 2004) indiquant l’existence d’une voie apoptotique nucléo-mitochondriale.

De plus, il a été rapporté que l’histone H1.2 joue un rôle important dans la transmission des signaux apoptotiques du noyau vers la mitochondrie suite à des cassures double brin de l’ADN (Konishi et al…, 2003). L’histone H1.2 nucléaire est libérée dans le cytoplasme par un mécanisme dépendant de p53 après des cassures double brin de l’ADN et induit la libération de cytochrome c par des mitochondries isolées d’une manière dépendante de Bak (Konishi et al., 2003). La réduction de l’expression de H1.2 a renforcé la résistance cellulaire à l’apoptose induite par l’irradiation aux rayons X ou l’étoposide (Konishi et al., 2003).

En outre, le récepteur nucléaire orphelin Nur77 (également connu sous le nom de TR3) a récemment été couplé à la machinerie apoptotique Bcl-2 au niveau des mitochondries (Lin et al., 2004). La liaison de Nur77 à la région de la boucle N-terminale de Bcl-2, située entre ses domaines BH4 et BH3, induit un changement de conformation de Bcl-2 qui expose son domaine BH3, ce qui entraîne la conversion de Bcl-2 d’un protecteur à un tueur (Lin et al., 2004). Il est intéressant de noter que des niveaux élevés d’un membre de la famille Nur77 ont été associés à des réponses favorables aux agents chimiothérapeutiques chez les patients (Shipp et al., 2002).

En outre, lors d’un stress cellulaire, y compris les médicaments chimiothérapeutiques, des membres proapoptotiques spécifiques de la famille Bcl-2 sont activés, déréprimés ou induits, et agissent ainsi comme des capteurs. L’activité des protéines BH3 est contrôlée par plusieurs mécanismes, qui maintiennent ces protéines à l’écart des homologues multidomaines de la famille Bcl-2 dans des circonstances normales, tout en permettant leur activation rapide dans des conditions de stress (Bouillet et Strasser, 2002). Comme mentionné ci-dessus, les protéines de la famille Bcl-2 telles que Bid, Puma ou Noxa sont sous le contrôle transcriptionnel du suppresseur de tumeur p53 et sont donc régulées à la hausse en réponse aux agents endommageant l’ADN (Oda et al., 2000 ; Yu et al., 2001 ; Sax et al., 2002). La protéine BH3 uniquement Bim, qui est associée au cytosquelette en se liant aux microtubules, est libérée et active la voie intrinsèque après un traitement au taxol, qui agit sur l’assemblage des microtubules (Sunters et al., 2003). Récemment, il a été démontré que le paclitaxel induit une accumulation de Bim et une apoptose dépendante de Bim dans les tumeurs épithéliales in vitro et également in vivo (Tan et al., 2005). Les protéines BH3 actives se lient et contrecarrent les membres antiapoptotiques et, dans certains cas, activent les membres multidomaines proapoptotiques de la famille Bcl-2, ce qui entraîne la perte de perméabilité de la membrane mitochondriale (Bouillet et Strasser, 2002). La façon dont les protéines Bcl-2 induisent une perturbation de la membrane externe mitochondriale fait encore l’objet de débats et peut impliquer la capacité de formation de pores et d’auto-oligomérisation de certaines protéines de la famille Bcl-2, la modulation du pore de transition de perméabilité mitochondriale par les protéines de la famille Bcl-2 et/ou des modifications lipidiques et des interactions entre protéines lipidiques au sein des membranes mitochondriales. De plus, les agents chimiothérapeutiques tels que le paclitaxel provoquent une hyperphosphorylation et une inactivation de Bcl-2 et, simultanément, favorisent l’ouverture du pore de transition de perméabilité (PT) (Ruvolo et al…, 2001).

Les médicaments chimiothérapeutiques peuvent également induire ou faciliter la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe par des modifications des potentiels redox cellulaires dues à une génération accrue d’espèces réactives de l’oxygène (ou à une diminution de leur détoxification), à une déplétion du glutathion réduit ou à une déplétion du NADPH, car le mégachanal mitochondrial possède plusieurs sites sensibles aux redox (Debatin et al., 2002). De plus, les changements dans le métabolisme énergétique, par exemple la diminution de l’ADP et de l’ATP, pourraient faciliter l’ouverture du complexe du pore de transition de perméabilité (PTPC), puisque l’ADP et l’ATP sont les ligands physiologiques du translocateur de nucléotides d’adénine, qui fonctionnent comme des inhibiteurs endogènes du PTPC (Costantini et al., 2000). De plus, le découplage ou l’inhibition de la chaîne respiratoire ou l’alcalinisation de la matrice peuvent favoriser la perméabilisation de la membrane mitochondriale. En outre, les messagers lipidiques tels que la céramide, qui est générée dans les cellules exposées à plusieurs stimuli induisant l’apoptose, y compris les médicaments cytotoxiques, peuvent contribuer à la perméabilisation de la membrane mitochondriale (Susin et al., 1997). À des concentrations élevées. certains médicaments chimiothérapeutiques, par exemple l’étoposide ou le paclitaxel, peuvent également induire une perméabilisation de la membrane externe mitochondriale dans des mitochondries isolées (Robertson et al., 2000 ; Kidd et al, 2002).

En outre, un nombre croissant de médicaments anticancéreux expérimentaux, dont l’arsénite, le lonidamide, le rétinoïde synthétique CD437 ou le produit naturel acide bétulinique, se sont avérés agir directement sur les mitochondries (Debatin et al., 2002). Par exemple, l’acide bétulinique a été signalé comme déclenchant l’apoptose en induisant directement la perte du potentiel de la membrane mitochondriale dans des mitochondries isolées d’une manière qui n’est pas affectée par l’inhibiteur de caspase Z-VAD-fmk et qui est pourtant inhibée par le BA, un inhibiteur de la PTPC, ou par Bcl-2 et Bcl-XL (Fulda et al, 1998b).

Stratégies ciblant la voie intrinsèque

Protéines de la famille Bcl-2

Puisque les protéines antiapoptotiques Bcl-2, qui bloquent puissamment la voie intrinsèque de l’apoptose, sont trouvées à des niveaux élevés dans les cancers humains d’origine hématologique et non hématologique (Cotter, 2004), elles représentent des cibles prometteuses pour des interventions thérapeutiques. Par conséquent, plusieurs stratégies ont été développées pour cibler les protéines Bcl-2, par exemple, des techniques antisens, des peptides à domaine BH3 ou des petites molécules synthétiques interférant avec la fonction des protéines de type Bcl-2. Pour réguler à la baisse l’expression de Bcl-2, des oligonucléotides antisens Bcl-2 (genasense) ont été développés par Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, USA). Genasense est un oligonucléotide phosphorothioate synthétique à simple brin de 18 bases qui cible sélectivement les six premiers codons (c’est-à-dire 18 bases) du cadre de lecture ouvert de l’ARNm codant pour la protéine Bcl-2 (Cotter, 2004). Le traitement par genasense a nettement renforcé l’activité antitumorale de nombreux médicaments chimiothérapeutiques, par exemple les taxanes, les anthracyclines, les alkylateurs ou les agents contenant du platine (Cotter, 2004). Dans un modèle préclinique de mélanome, le prétraitement avec genasense a augmenté la chimiosensibilité du mélanome humain (Jansen et al., 1998). De même, dans un essai clinique, on a signalé que le génasense agissait comme chimiosensibilisateur pour la dacarbazine chez des patients atteints de mélanome malin (Jansen et al., 2000). Pour optimiser la thérapie antisens, des oligonucléotides antisens bispécifiques dirigés contre une séquence hautement homologue de Bcl-2 et Bcl-xL, mais absente de l’ARNm de Bcl-xS, ont ensuite été conçus (Zangemeister-Wittke et al., 2000). La régulation simultanée à la baisse de Bcl-2 et Bcl-xL a induit l’apoptose et une chimiosensibilité accrue dans diverses cellules cancéreuses (Gautschi et al., 2001 ; Tortora et al., 2003 ; Milella et al., 2004 ; Yamanaka et al., 2005).

En outre, des peptides à domaine BH3 ou des inhibiteurs synthétiques à petite molécule ont été développés pour cibler les protéines anti-apoptotiques de type Bcl-2. Le domaine BH3 comprend une hélice α amphipathique de neuf acides aminés qui se lie à une poche hydrophobe des protéines de type Bcl-2 (Cory et Adams, 2002). De même, les peptides du domaine BH3 visent à perturber ce complexe, sensibilisant ainsi les cellules cancéreuses à l’apoptose (Letai et al., 2002). De plus, la substitution du domaine BH3 de Bid par des acides aminés non naturels sur la surface opposée à la région d’interaction par agrafage d’hydrocarbures a permis d’obtenir des peptides BH3 stabilisés appelés SAHBs (stabilized α-helix of Bcl-2 domains), aux propriétés pharmacologiques améliorées (Walensky et al., 2004). Ces peptides BH3 stabilisés ont déclenché l’apoptose dans une variété de lignées cellulaires leucémiques et ont également inhibé la croissance des xénogreffes de leucémie chez les souris sans effets secondaires indésirables (Walensky et al., 2004).

De plus, plusieurs composés de petites molécules interférant avec la fonction Bcl-2/Bcl-xL ont été identifiés. Le criblage d’une bibliothèque chimique pour les composés capables de se lier à la poche BH3 des protéines Bcl-2 a permis d’identifier HA14-1, un composé qui entre en compétition avec Bak pour la liaison à Bcl-2 (Wang et al., 2000). En criblant une bibliothèque de 16 320 composés présélectionnés pour leur capacité à déplacer un peptide BH3 fluorescent de Bak de Bcl-xL dans un test de polarisation fluorescente, Degterev et al. (2003) ont identifié deux classes d’agents appelés inhibiteurs de BH3 (BH3I), qui perturbent également le complexe Bcl-xL avec Bax et Bad dans les cellules intactes.

Utilisant un criblage basé sur la résonance magnétique nucléaire (RMN), une synthèse parallèle et une conception basée sur la structure, un inhibiteur à petite molécule des protéines antiapoptotiques Bcl-2, Bcl-X(L) et Bcl-w, l’ABT-737, a été récemment découvert. ABT-737 a été efficace en tant qu’agent unique contre certains lymphomes et tumeurs solides et a montré une cytotoxicité synergique avec les chimiothérapies et les radiations (Oltersdorf et al., 2005).

Agonistes de Smac/DIABLO

Pour la conception de petites molécules potentiellement thérapeutiques pour cibler XIAP, le sillon de liaison du domaine BIR3 de XIAP, auquel Smac/DIABLO se lie après sa libération des mitochondries, a attiré le plus d’attention. L’analyse structurale a fourni un raisonnement clair pour la synthèse de petits composés qui peuvent imiter l’activité de déplacement de la caspase-9 de Smac/DIABLO du domaine BIR3 de XIAP (Chai et al., 2000 ; Wu et al., 2000). Pour améliorer la délivrance intracellulaire, les peptides Smac ont été liés à un support, par exemple, le motif de transduction protéique de la protéine Tat du VIH (Fulda et al., 2002), la séquence de la pénétratine de Drosophila antennapaedia (Arnt et al., 2002) ou un tronçon de polyarginine (Yang et al., 2003b). Un heptapeptide représentant l’extrémité N-terminale de Smac/DIABLO mature, qui est essentiel pour se lier à XIAP, a été signalé comme favorisant l’activation des caspases et sensibilisant diverses lignées cellulaires tumorales ainsi que les cellules tumorales primaires dérivées de patients à l’apoptose induite par la ligature des récepteurs de mort ou par des médicaments cytotoxiques (Fulda et al., 2002). Fait important, les peptides Smac ont même renforcé l’activité antitumorale de TRAIL in vivo dans un modèle de xénogreffe intracrânienne de gliome malin (Fulda et al., 2002b). De même, un peptide 8-mer (AVPIAQKS) fusionné au domaine de transduction protéique de la pénétratine de Drosophila antennapaedia a été capable de pénétrer dans des cellules de cancer du sein, de lier XIAP et cIAP1, et de potentialiser l’activité caspase induite par un certain nombre de médicaments anticancéreux, notamment le paclitaxel, l’étoposide, la 7-éthyl-10-hydroxycamptothécine (SN-38) et la doxorubicine (Arnt et al., 2002). En outre, sur la base de la structure tridimensionnelle de Smac/DIABLO en complexe avec XIAP BIR3, des peptidomimétiques de Smac ont été conçus, qui ont coopéré avec TRAIL, TNFα, cisplatine ou étoposide pour déclencher l’apoptose dans les cellules tumorales (Li et al., 2004 ; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).

Par la suite, des petites molécules antagonistes non peptidiques de XIAP, qui ont été dérivées par criblage d’une bibliothèque de phages ou d’une bibliothèque de polyphénylurées, ont été développées pour cibler les IAP (Schimmer et al., 2004 ; Wang et al., 2004). De plus, le produit naturel embéline provenant de l’herbe japonaise Ardisia a récemment été découvert comme un inhibiteur de XIAP perméable aux cellules, non peptidique et de faible poids moléculaire, par un criblage computationnel basé sur la structure d’une base de données de structures tridimensionnelles de plantes médicinales traditionnelles (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Il a été démontré que l’embéline surmonte efficacement l’effet protecteur de XIAP dans les cellules cancéreuses de la prostate ayant des niveaux endogènes élevés de XIAP ou dans les cellules Jurkat transfectées avec XIAP en se liant au domaine BIR3 de XIAP (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Ainsi, les agonistes de Smac ou les antagonistes de XIAP de faible poids moléculaire peuvent être des candidats prometteurs pour la thérapie du cancer en potentialisant l’efficacité des thérapies cytotoxiques de manière sélective dans les cellules cancéreuses.