Vírus és sejtek
Eltérő jelzés hiányában minden kísérletet MDCK sejteken A/Memphis/14/96-M (H1N1) klinikai influenza vírus izolátummal végeztünk, amelyet Dr. Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, USA) bocsátott rendelkezésünkre. Az 5. ábrán leírt vírusokat a köszönetnyilvánításban felsorolt kollégák bocsátották rendelkezésünkre.
A Neu5Ac2-6Gal végződésű oligoszacharidok fokozott expressziója érdekében stabilan 2,6-szialiltranszferázzal transzfektált MDCK sejteket és MDCK-SIAT1 sejteket korábban már leírtuk . Mindkét sejttípust 2 mM L-glutaminnal, 10% magzati borjúszérummal és antibiotikumokkal (100 mg/ml sztreptomicin és 100 U/ml penicillin) kiegészített DMEM-ben (Gibco) szaporítottuk.
Folyékony táptalaj
A vírusfertőzés folyékony fenntartó táptalajaként (MM) L-glutamint, 0,1% BSA-t (Sigma, A-0336), antibiotikumokat és 1 μg/ml TPCK tripszint (Sigma, T-1426) tartalmazó Eagle’s MEM-et használtunk.
1,8%-os Bacto-Agar (BD, 214010) és 2%-os metilcellulóz (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s 2%-ban, Fluka) állományokat készítettünk desztillált vízben a korábban leírtak szerint .
Az Avicel RC/CL gyártója (FMC BioPolymer) szíveskedett háromféle Avicelt (RC-581, RC-591 és CL-661) biztosítani a teszteléshez. Az Avicel törzsszuszpenziókat úgy készítettük el, hogy 2,4 g Avicel port 100 ml desztillált vízben standard mágneses keverőn 1 órán keresztül diszpergáltunk. Az agar-, MC- és Avicel-készleteket 20 perces 121 °C-on végzett autoklávozással sterilizáltuk, majd szobahőmérsékleten tároltuk.
A fedőrétegeket MC, Avicel vagy olvasztott agar törzsoldatainak és azonos térfogatú, kétszeres erősségű fenntartó táptalajnak a keverésével készítettük. Az MC és az Avicel koncentrációjának változtatása érdekében az eredeti törzsoldatokat steril vízzel hígítottuk. Az agar overlay-t 42-44°C-on, a két másik overlay-t 20 vagy 37°C-on készítettük.
A koncentrált (2,4%-os) Avicel-készletek jellemzően nem váltak szét a tárolás során, a hígított Avicel-alapú overlay-k azonban kevésbé voltak stabilak. Ha szükségesnek ítéltük, az Avicel-készleteket összekevertük, és az Avicel-felületeket felhasználás előtt mindig összekevertük kézzel történő rázással vagy vortexeléssel. Az overlay-ek lassú szétválasztása a sejtmonolayereken való alkalmazásuk után nem befolyásolta a vizsgálati eredményeket.
Plaque assay 6 lyukú lemezekben
Egy órával azután, hogy a sejtmonolayereket 30-50 plaque-képző egységnyi vírussal fertőztük 1 ml trypsin nélküli fenntartó médiumban, eltávolítottuk a vírusinokulumot, a sejteket 3 ml különböző overlay médiummal fedtük le és a kultúrákat 35°C-on, 5%-os CO2 atmoszférában inkubáltuk. Az MC és Avicel fedőközegek esetében ügyeltünk arra, hogy az inkubációs idő alatt ne zavarjuk meg a lemezeket, hogy elkerüljük a nem egyenletes plakkok kialakulását. Három nap inkubáció után eltávolítottuk a fedőlemezeket és fixáltuk a sejteket. Az agar fedőréteget fémspatula segítségével távolítottuk el; az MC, Avicel és folyékony fedőrétegeket szívással távolítottuk el. A sejteket MEM-ben lévő 4%-os paraformaldehid oldattal fixáltuk 30 percig 4°C-on, majd PBS-szel mostuk. A sejtek minden további kezelését szobahőmérsékleten végeztük. A sejteket permeabilizáltuk, és ezzel egyidejűleg a maradék aldehidcsoportokat blokkoltuk úgy, hogy a sejteket 10-20 percig inkubáltuk 1 ml/lyuk 0,5% Triton-X-100 és 20 mM glicint tartalmazó oldattal PBS-ben. A vírusfertőzött sejteket immunfestettük az influenza A vírus nukleoproteinjére specifikus monoklonális antitestekkel történő 1 órás inkubálással (melyet Dr. Alexander Klimov, Centers for Disease Control, USA, szíves hozzájárulásával biztosított), majd 1 órás inkubálás peroxidázzal jelölt anti-egér antitestekkel (DAKO, Dánia) és 30 perces inkubálással csapadékképző peroxidáz szubsztrátokkal. Az immunreagensek munkahígításainak elkészítéséhez 10%-os normál lószérum és 0,05%-os Tween-80 oldatot használtunk PBS-ben. A sejteket az elsődleges és másodlagos antitestek után háromszor 3-5 percig tartó inkubálással mostuk 0,05%-os Tween-80-mal PBS-ben. Peroxidáz-szubsztrátként vagy kész True Blue™ (KPL), vagy 0,05 M nátrium-acetát pufferben, pH 5,5-ben készített és 0,03% H2O2-t tartalmazó aminoetil-karbazol (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) oldatot alkalmaztunk. A festett lemezeket csapvízzel mostuk a reakció leállítása érdekében, majd megszárítottuk. A True Blue festés esetében, amely viszonylag instabil a vizes oldatokban, a lemezeket fordítva szárítottuk, hogy minimalizáljuk a kifehéredést. A festett lemezeket síkágyas szkennerrel szkenneltük, az adatokat pedig az Adobe Photoshop 7.0 szoftverrel rögzítettük.
Az immunfestés alternatívájaként egyes kísérletekben a plakkokat mint elpusztult sejtek területeit tártuk fel. Ebből a célból az átfedések eltávolítása után a sejteket 1%-os kristályviola-oldattal festettük meg 20%-os metanolban, vízben oldott 1%-os kristályviola-oldattal.
Változatai a vírus titrálásának 96 lyukú lemezekben
1. Standard változat
MDCK vagy MDCK-SIAT1 sejtmonoszlopokat fertőztünk 96 lyukú lemezekben a vírus 50 μl/lyuk sorozatos hígítású, tripszin nélküli fenntartó közegben lévő hígításával. 1 órás, 35°C-on, 5%-os CO2-on történő inkubáció után eltávolítottuk a vírust, 100 μl/lyuk MC vagy Avicel fedőközeget adtunk hozzá, és további 24 órán át inkubáltuk a sejteket, hogy a plakkok kialakulhassanak. A fixálást és az immunfestést a 6 lyukú lemezeknél fent leírtak szerint végeztük, de lyukanként 50 μl reagenssel.
2. Egyszerűsített változat
A vizsgálatot pontosan úgy végeztük, mint a standard változatban, a következő módosításokkal. A vírussal történő 1 órás inkubáció után nem távolítottuk el az inokulumot. Adtunk 100 μl/lyuk Avicel overlay médiumot, és a lemezt vagy kézzel kopogtatva, vagy lemezkeverővel kevertük meg. A táptalaj megnövelt mennyiségű tripszint (1,5 μg/ml) tartalmazott, hogy kompenzáljuk az overlay hígulását a lyukakban lévő vírustartalmú anyaggal.
Plaque gátlási vizsgálat
Noel Roberts (Roche Products, UK) szíveskedett rendelkezésre bocsátani a neuraminidáz inhibitor oseltamivir-karboxilátot (OC). Az OC 10-szeres sorozatos hígításait 50 μl/lyukban, tripszin nélküli fenntartó közegben (koncentrációtartomány 4 nM és 400 μM OC között) adtuk az MDCK-SIAT1 sejtek monoszintű rétegéhez 96 lyukú lemezekben. Ezután 50 μl/lyuk vírushígításokat adtunk hozzá (20-40 plakkképző egység/lyuk). A lemezt összekevertük és 1 órán át 35°C-on inkubáltuk, hogy a vírusfertőzés megindulhasson. Ezt követően 100 μl/lyuk 1,2%-os Avicel fedőközeget adtunk hozzá, amely 2 μg/ml tripszint tartalmazott, a kultúrákat 24 órán át inkubáltuk, majd a fent leírtak szerint fixáltuk és immunfestettük őket.
A 6 lyukú lemezek esetében 0,75 ml aliquot hatóanyagot és inhibitort, valamint 1,5 ml aliquot Avicelt adtunk hozzá lyukanként, és a plakkokat 3 nappal a fertőzés után immunfestettük.
A plakkokat 3 nappal a fertőzés után immunfestettük.