- Melyiket válasszuk mikrobiom vizsgálatokhoz
- Mi az a 16S rRNS génszekvenálás?
- Mi a shotgun metagenomikai szekvenálás?
- 16S/ITS szekvenálás vs. shotgun metagenomikai szekvenálás
- Taxonómiai felbontás
- Funkcionális profilalkotás
- Mikrobiális lefedettség és ajánlott mintatípus
- Téves pozitívumok
- Host DNS interferencia
- DNS-bemenet
- Here to Help
- Tudja meg, melyik szekvenálási módszer a legjobb az Ön számára. Beszéljen a ZymoBIOMICS szekvenálási szolgáltatásokat nyújtó szakértőkkel.
Melyiket válasszuk mikrobiom vizsgálatokhoz
16S szekvenálás vagy shotgun szekvenálás? Szinte minden mikrobiomkutató felteszi magának ezt a kérdést, amikor új tanulmányt tervez, mivel a mikrobiom-kiadványok túlnyomó többsége vagy 16S rRNS génszekvenálást vagy shotgun metagenomikai szekvenálást használ a későbbi mikrobiális profilalkotáshoz vagy metagenomikai elemzésekhez szükséges nyers adatok előállításához. Mindegyik módszernek megvannak az előnyei és hátrányai, ezért melyik módszert érdemes választani?
Mi az a 16S rRNS génszekvenálás?
A 16S rRNS génszekvenálás, vagy egyszerűen 16S szekvenálás PCR-t használ a bakteriális 16S rRNS gén hipervariábilis régióinak (V1-V9) részleteinek megcélzására és felerősítésére1. A különálló mintákból származó amplikonokat ezután molekuláris vonalkóddal látják el, összevonják és szekvenálják. A szekvenálás után a nyers adatokat bioinformatikai csővezetékkel elemzik, amely magában foglalja a trimmelést, a hibajavítást és a 16S referenciaadatbázissal való összehasonlítást. Miután a leolvasásokat filogenetikai rangsorba sorolták, létrehozható egy taxonómiai profil. Hasonlóképpen, az ITS-szekvenálás ugyanezt a stratégiát követi, de a gombák genomjában található ITS (Internal transcribed spacer) régiót veszi célba.
Mi a shotgun metagenomikai szekvenálás?
A 16S-szekvenálással ellentétben, amely csak a 16S rRNS-géneket veszi célba, a shotgun metagenomikai szekvenálás a minta összes adott genomiális DNS-ét szekvenálja. A könyvtárkészítési munkafolyamat hasonló a hagyományos teljes genom szekvenáláshoz, beleértve a véletlenszerű fragmentálást és az adapter-ligációt. A shotgun metagenomikai adatok taxonómiai elemzésének tipikus munkafolyamata magában foglalja a minőségi trimmelést és a teljes genomokat (pl. Kraken2 és Centrifuge3) vagy kiválasztott markergéneket (MetaPhlAn4 és mOTU5) tartalmazó referenciaadatbázissal való összehasonlítást a taxonómiai profil létrehozása érdekében. Mivel a shotgun metagenomikai szekvenálás a minta összes genetikai információját lefedi, az adatok további elemzésekre, pl. metagenomikai összeállításra és binningre, metabolikus funkcióprofilozásra és antibiotikum-rezisztencia génprofilozásra is felhasználhatók.
16S/ITS szekvenálás vs. shotgun metagenomikai szekvenálás
Ha vizsgálatához a taxonómiai profilalkotáson túl genomikai elemzésekre, például metabolikus útvonalelemzésre is szükség van, akkor a nagyobb genomikai lefedettség és adatkimenet miatt a shotgun metagenomikai szekvenálást kell megfontolnia. Ha a vizsgálat fő célja az összetétel profilozása, mindkét technikának vannak előnyei és hátrányai, amelyeket figyelembe kell venni (1. táblázat).
.
Taxonómiai felbontás
A 16S/ITS szekvenálás taxonómiai felbontása a célzott változó régióktól, magától az organizmustól és a szekvenciaelemző algoritmustól függ. Az utóbbi években néhány hibajavító módszer, pl. a DADA26 , drámaian javította e technika pontosságát és taxonómiai felbontását. A DADA2 segítségével számos szervezet esetében a fajszintű felbontás a szokásos 16S szekvenálással ma már valósággá vált. Elméletileg azonban a shotgun metagenomikai szekvenálással törzsszintű felbontás érhető el, mivel minden genetikai variációt le tud fedni. Bár a gyakorlatban a törzsszintű felbontás pontossága még mindig technikai kihívásokkal küzd. Ennek ellenére a shotgun metagenomikai szekvenálás a 16S/ITS szekvenáláshoz képest nagyobb felbontást ér el.
Funkcionális profilalkotás
Ha a metabolikus funkcióelemzés a cél, a legtöbb kutató gyorsan elnézi a 16S és ITS szekvenálást. Vannak azonban olyan eszközök, amelyekkel a taxonómiai adatokból következtetni lehet az anyagcsere-funkcióra, pl. a PICRUSt7. Általában azonban a shotgun metagenomikai szekvenálást gyakran használják, ha funkcionális profilalkotásra van szükség a további génlefedettség miatt.
Mikrobiális lefedettség és ajánlott mintatípus
A shotgun szekvenálás az összes metagenomi DNS-t vizsgálja, míg a 16S szekvenálás csak a 16S rRNS géneket, ami szintén szenved a hiányos primerlefedettségtől. Következésképpen az előbbi nagyobb tartományokon átívelő lefedettséggel rendelkezik. Akkor miért jelöli az 1. táblázat a 16S/ITS szekvenálást jobbnak a baktériumok és gombák lefedettségét illetően? Ez a rendelkezésre álló referenciaadatbázisok fajlefedettségéből ered, mivel e szekvenálási megközelítések taxonómiai előrejelzése nagymértékben függ a használt referenciaadatbázistól. Jelenleg a 16S/ITS adatbázisok lefedettsége sokkal jobb, mint a teljes genom adatbázisoké. Ennek az az oka, hogy az emberi mikrobiomhoz kapcsolódó mikrobák teljes genomjai sokkal jobban tanulmányozottak, mint a más környezetekhez kapcsolódó mikrobák genomjai. Ezért ajánlott a shotgun metagenomikus szekvenálást alkalmazni a humán mikrobiomhoz kapcsolódó minták, például széklet és nyál esetében, ha a taxonómiai profilalkotás a fő cél.
A metagenomikus szekvenálás ráadásul nagyobb mértékben függ a referenciaadatbázistól. Ha például egy baktériumnak nincs közeli rokon képviselője a 16S-referenciaadatbázisban, akkor esetleg magasabb filogenetikai rangsorban vagy ismeretlen baktériumként azonosítható. A shotgun metagenomikai szekvenálás esetében azonban, ha egy baktériumnak nincs közeli rokona (ugyanabból a nemzetségből származó genom) a referencia genom adatbázisban, akkor valószínűleg teljesen lemarad róla. A ZymoBIOMICS Spike-in Control I például két, az emberi mikrobiomtól idegen mikrobát tartalmaz (Imtechella halotolerans és Allobacillus halotolerans), amelyek genomja korábban nem állt rendelkezésre. Ha ezt egy székletmintába spike-oljuk és shotgun szekvenálással szekvenáljuk, a legtöbb bioinformatikai pipeline teljesen kihagyja őket, hacsak manuálisan nem adjuk hozzá ezt a két genomot a referenciaadatbázishoz. Ha viszont 16S-szekvenálással elemezzük őket, akkor azonosítani fogjuk őket, mivel 16S-szekvenciájuk jelen van a referenciaadatbázisokban.
Téves pozitívumok
A hibajavító eszközök, mint például a DADA2, nemcsak a 16S/ITS-szekvenálás taxonómiai felbontását javítják, hanem a pontosságot is. Ez bebizonyosodott, amikor a mikrobiális mintaközösségből (pl. ZymoBIOMICS Microbial Community Standard) származó DNS-t szekvenáltuk. Minden 16S szekvencia hibátlanul, azaz hamis pozitív szekvencia nélkül nyerhető vissza. A shotgun metagenomikai szekvenálás esetén azonban, hacsak nincs tökéletes reprezentatív genom a referencia adatbázisban egy szekvenált mikroba számára, a bioinformatikai elemzés valószínűleg több “szorosan rokon” genom létezését jelzi előre. Ezek a szorosan rokon genomok származhatnak ugyanazon nemzetség különböző fajaiból vagy akár különböző nemzetségekből is. Tegyük fel például, hogy van három szorosan rokon mikroba, A, B és C, és van néhány közös szekvenciájuk. Az A faj csak B-vel osztozik néhány szekvencián, és néhány más szekvencián csak C-vel. Ha a referencia adatbázis csak B és C genomjait tartalmazza, amikor A-t szekvenálták, a bioinformatika azt fogja megjósolni, hogy B és C is jelen van. Például A és B egyaránt lehet az Escherichia coli törzse, C pedig a Salmonella enterica; a B és C által egyedüliként megosztott szekvenciák származhatnak horizontális génátvitelből, ami közeli rokon mikrobák között gyakori. Emiatt a 16S/ITS szekvenálás jobb a hamis pozitív eredmények tekintetében.
Host DNS interferencia
A túl sok host DNS jelenléte nem specifikus amplifikációt okozhat a 16S és ITS szekvenálás könyvtárkészítési folyamatában, de a hatás a PCR ciklusok beállításával és a primerek megváltoztatásával szabályozható. Másrészt a gazdaszervezeti DNS interferenciája sokkal nehezebb problémát jelent a shotgun metagenomikai szekvenálásnál, annak ellenére, hogy a szekvenálás költségei drasztikusan csökkentek. A minta típusától függően egyes minták >99%-ban tartalmazhatnak humán gazdaszervezet DNS-t, ami nemcsak a szekvenálási költségeket növeli, hanem bizonytalanságot is hoz a mérésbe. Ezért sok kutató a shotgun szekvenálás könyvtárkészítése előtt megvizsgálja a gazdaszervezet DNS-ének kiürítését, pl. a HostZERO Microbial DNA Kit-et. Előfordulhat azonban, hogy a gazda DNS-depléció után nem marad elegendő mikrobiális genomiális DNS a shotgun szekvenáláshoz, amelyhez általában legalább 1ng bevitel szükséges. A gazdaszervezeti DNS interferenciája az oka annak, hogy a sekély sörétes szekvenálás csak humán székletmintákhoz ajánlott.
DNS-bemenet
Míg a sörétes metagenomikai szekvenálás legalább 1 ng DNS-bemenetet igényel, a 16S/ITS szekvenálás sokkal érzékenyebb, a bemeneti minimum femtogramm vagy akár a 16S rRNS gének 10 példánya is lehet.
Here to Help
A 16S-szekvenálás és a shotgun metagenomikai szekvenálás közötti választás kritikus lépés minden mikrobiom-vizsgálat esetében. A költségvetés mellett a projekt számos szempontját is figyelembe kell venni, beleértve a minta típusát, a kívánt elemzéseket, a taxonómiai felbontást és a célszervezeteket. E szempontok figyelembevétele segít a megfelelő szekvenálási módszer kiválasztásában a következő mikrobiom-projekthez. A ZymoBIOMICS mikrobiom szekvenálási szolgáltatásai 16S, ITS és shotgun szekvenálást kínálnak teljes körű szolgáltatásként a DNS extrahálástól a szekvenáláson át a bioinformatikaig. A Zymo Research szekvenálási és bioinformatikai szakértői szívesen segítenek kiválasztani a megfelelő szekvenálási módszert az Ön vizsgálatához.
Tudja meg, melyik szekvenálási módszer a legjobb az Ön számára. Beszéljen a ZymoBIOMICS szekvenálási szolgáltatásokat nyújtó szakértőkkel.
További információ
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Next-Generation Metagenomics: Methodological Challenges and Opportunities. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: ultragyors metagenomikai szekvenciaosztályozás pontos igazítások segítségével. Genome Biology 2014 15(3): R46.
3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuga: metagenomi szekvenciák gyors és érzékeny osztályozása. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. Sunagawa S, et al. Metagenomic species profiling using universal phylogenetic marker genes. Nature Methods 2013 10(12): 1196-1199.
6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: Nagy felbontású minta következtetés Illumina amplikon adatokból. Nature Methods 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNS marker gene sequences. Nature Biotechnology 2013 31(9): 814-821.
2019. november 13.