- A hipoxia a M. smegmatis recA és recX génjeinek expresszióját
- ΔrecX és ΔrecA ΔrecX mutáns törzsek szerkesztése
- Genotípusos és fenotípusos elemzés az M. smegmatis ΔrecX és ΔrecAΔrecX mutánsok vizsgálata
- A M. smegmatis ΔrecA és ΔrecA ΔrecX mutáns törzsek a vad típusú törzshez képest károsodott növekedést és csökkent sejthozamot mutatnak
- A recA, de nem a recX deléciója érzékenyebbé teszi az M. smegmatist a DNS-károsítókkal szemben
- Túlélés különböző koncentrációjú DNS-károsító szerekkel történő kezelés után
- A recA és recX gének expresszióját DNS-károsodás indukálja
- Záró megjegyzések
- A használt rövidítések:
A hipoxia a M. smegmatis recA és recX génjeinek expresszióját
A fertőzés és a proliferáció során az M. tuberculosis olyan fiziológiai stresszkörülményeknek van kitéve, mint a hipoxia és a savas pH stressz, amelyek veszélyeztethetik a túlélését38,39,40 . Az akut hipoxiás stressz például leállítja a DNS-replikációt és robusztus DNS-károsodást vált ki41,42,43. Az SOS-útvonal génjeinek, köztük az umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB és uvrD gének expressziójának növekedése kezdődik a DNS-károsodás hatására44,45,46. Ennek érdekében a M. smegmatisban és a M. tuberculosisban a látens fertőzés során a hipoxia által indukált génexpressziós profilok készítése értékes betekintést nyújtott a látens tuberkulózis bacillusok természetébe és kezelésébe47.
A M. tuberculosisban48, a Thiobacillus ferrooxidansban49 és a Streptomyces lividansban50 végzett korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a recA együtt íródik a recX-szel. Továbbá a RecA (az SOS-válasz pozitív szabályozója) túlterjedését RecX hiányában toxikusnak találták bizonyos baktériumfajokban, többek között a Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 és Xanthomonas oryzae53 esetében. Ezek az eredmények összhangban vannak azzal az elképzeléssel, hogy a RecX anti-rekombinázként működik a RecA14 által elősegített nem megfelelő rekombinációs események elfojtására. Ezzel szemben a RecA túlexpressziója az E. coli ΔrecX törzsben nem káros, és a recX deléciója nem befolyásolja a recA expresszióját54. A recX transzkripció az E. coli-ban a recA-hoz képest normál növekedési körülmények között le van szabályozva, mivel a recA és a recX kódoló szekvenciák között egy transzkripciós terminációs hely található. A transzkripciós átolvasásból származó recA-recX mRNS-átirat azonban a teljes recA mRNS-tartalom 5-10%-a között halmozódik fel54. A recX transzkript alig volt kimutatható az E. coli vegetatív növekedése során, de a recX robusztus expressziója a DNS-károsító anyagokkal való kezelést követően következik be15,55.
Az M. smegmatis és az M. tuberculosis genomja egyaránt tartalmaz egy-egy recA és recX kópiát egyetlen operonban. E gének aerob és hipoxiás növekedés alatti expressziójának és szabályozásának vizsgálatára a M. smegmatisban, a M. tuberculosis általánosan használt helyettesítő modelljében, az mRNS relatív abundanciáját különböző növekedési fázisokban RT-qPCR teszttel mértük, és normalizáltuk a konstitutívan expresszálódó 16S rRNS génhez képest. Az M. smegmatis recA és recX mRNS ciklusküszöb (Ct) értékeit az16S rRNS gén Ct értékéhez képest normalizáltuk. Az E. coli15,55 génnel ellentétben a recA mRNS transzkriptum jelentős mennyisége volt megfigyelhető a korai log-fázisban mind aerob, mind hipoxikus tenyésztési körülmények között (1A. ábra). Érdekes módon a hipoxiás körülmények 1,5-szeresére növelték a recA mRNS felhalmozódását a log fázis közepén, majd ezt követően csökkent, ahogy a sejtek a stacionárius fázisba léptek. Hasonló mintázat volt megfigyelhető a recX mRNS mennyiségénél aerob és hipoxiás körülmények között is, bár csökkentett szinten (1B. ábra). Ezek a megfigyelések alátámasztják azt az elképzelést, hogy a két gén együtt íródik át és koordináltan szabályozott aerob és hipoxiás növekedési körülmények között. Érdekes módon nem volt különbség az mRNS mennyiségében aerob és hipoxiás növekedési körülmények között a korai log fázisban. A M. smegmatis növekedési fázis-specifikus markergének (sigH2 és sigH7)56 transzkripciós profilját használtuk a korai-log, a középső-log és a stacionárius fázis időpontjának megállapítására (1C. ábra). A M. tuberculosis multirezisztens klinikai törzseiben mind a recA, mind a recX mRNS szintjét magasabbnak találták, mint a gyógyszerérzékeny törzsekben, és a recX mRNS szintje a recA mRNS emelkedésével párhuzamosan nőtt57.
(A,B) A M. smegmatis mc2155 recA és recX gének relatív expressziós szintjei a korai log, a középső log és a stacionárius fázisban aerob és hipoxiás növekedési körülmények között. (C) A sigH2 és sigH7 gének relatív expressziós szintje a korai log, a középső log és a stacionárius fázisban. A jelintenzitásokat a Módszerek részben leírtak szerint határoztuk meg. A hisztogramok három független kísérlet átlagértékeit mutatják. Az expressziós szinteket meghatároztuk és normalizáltuk a 16S riboszómális RNS expressziójához, és az indukciós arányokat az aerob korai log fázisú tenyészetben lévő transzkript mennyiségéhez viszonyítva számoltuk ki. A hibasávok a 3 független ismétlésből számított átlag standard hibáját jelölik.
Meg kell azonban jegyezni, hogy az mRNS-szintek nem használhatók a megfelelő fehérjeszintek helyettesítőjeként. Ezért a RecA és RecX fehérjék mennyiségét a M. smegmatisban aerob és hipoxiás körülmények között anti-RecA és anti-RecX antitestek felhasználásával Western blot assay-vel mértük. A GroEL-t fehérje-terhelési kontrollként szondáztuk. Az immunoblotok denzitometriai elemzése kimutatta, hogy a sejtek magasabb RecA-szintet halmoztak fel hipoxikus növekedési körülmények között, mint aerob körülmények között (2A,B ábra). Az összehasonlító elemzés azt mutatta, hogy aerob növekedési körülmények között a sejtek következetesen 2-szer magasabb RecA-szintet halmoztak fel a középső log-fázisban a korai log-fázishoz képest, amely a stacionárius fázisban a korai log-fázisban látott szintre csökkent (2A,B ábra). Hasonló mintázat volt megfigyelhető a RecX esetében is, bár a szintek kevésbé voltak kifejezettek, mint a RecA esetében (2A,C ábra). Bár az mRNS- és fehérjeexpressziós mintázatok hasonlóak voltak, fontos különbségeket figyeltünk meg. Először is, a RecX fehérje alig volt kimutatható a korai log fázisban hipoxiás körülmények között. Másodszor, a RecA mRNS és fehérje mennyisége nagyobb volt a RecX-hez képest.
(A) A M. smegmatis mc2155 RecA és RecX fehérjék expressziós szintje aerob és hipoxikus növekedési körülmények között. (B) A RecA fehérje szintjének relatív változásainak számszerűsítése aerob és hipoxikus növekedési körülmények között. (C) A RecX-szintek relatív változásainak számszerűsítése aerob és hipoxikus növekedési körülmények között. A hisztogramok három független kísérletből származó Western blotok kvantifikálásával meghatározott átlagértékeket ábrázolnak. A terhelési kontroll GroEL-t használtuk a RecA és RecX expressziós szintek normalizálásához. A hibasávok a 3 független ismétlésből számított átlag standard hibáját jelölik. A szignifikáns különbségeket **p < 0,01 és *p < 0,05 jelzi. ns, nem szignifikáns.
Noha ezek az eredmények arra utalnak, hogy a M. smegmatis recA és recX gének hipoxiás körülmények között indukálódnak, nincs összefüggés a recX mRNS és a megfelelő fehérje mennyisége között a korai log fázisban. Mind a M. tuberculosisról, mind a M. smegmatisról kimutatták, hogy mRNS-átiratukat stabilizálják növekedést gátló körülmények között58,59,60. A lehetséges mechanizmusok közül a tRNS átprogramozás és a szelektív kodon-biased transzláció szerepet játszhat a mycobaktériumokban a hipoxiára adott válaszként61. A recX mRNS és a fehérje szintje közötti korreláció hiányának egyik lehetséges magyarázata a korai log fázisban a recX mRNS transzlációs repressziója lehet.
ΔrecX és ΔrecA ΔrecX mutáns törzsek szerkesztése
A RecA és RecX fehérjeszintek közötti különbség a M. smegmatisban a génexpresszió lehetséges szabályozására utal a transzkripció szintjén. Számos eddig vizsgált baktériumban a recX gén ugyanazon a kódoló szálon helyezkedik el a recA után, és a két gén együtt íródik át48,50,53,54,62,63 . A Xanthomonas patovarok lexA-recA-recX lókuszában azonban mindkét gén a saját promóteréről fejeződik ki64. Továbbá a D. radiodurans65,66, a B. subtilis67 és a N. gonorrhoeae26 esetében a recA és recX gének több száz kb hosszúságban elkülönülnek egymástól, és saját promóterükről íródnak át.
Számos mikobaktériumfajban, valamint néhány más baktériumban a recX kódoló szekvencia 5′ régiója átfedi a recA gén 3′ régióját. Az átfedés 32 bp hosszú az M. smegmatisban48 , míg az M. tuberculosisban68 és az M. leprae-ben69 az átfedés 35 bp. A recX deléció fenotípusos jellemzőkre gyakorolt hatását számos szervezetben vizsgálták7,10. A recX kiütéses mutánsai a RecA funkcióival összefüggő fenotípusok egész sorát mutatják: a B. subtilis recX inaktiválása érzékennyé tette a sejteket az MMS-re és H2O225 , a S. lividans recX mutánsok csökkent rezisztenciát mutattak az UV-károsodással szemben42 , a N. gonorrhoeae recX mutáns pedig kis mértékben csökkent a kettős szálszakadások által okozott DNS-károsodást túlélő képességében26. A recA és a recX gének deléciójának hatását a növekedési jellemzőkre és a DNS-károsodás javítására azonban még egyetlen szervezetben sem vizsgálták. Ráadásul a recX in vivo szerepének teljes megértése a mikobaktériumokban nem teljesen tisztázott.
A korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a M. smegmatis ΔrecA törzs érzékenységet mutat az UV-indukált DNS-károsodással szemben, és nem képes elősegíteni a HR52. A recA mutációt a recX deléciójával kombináltuk, hogy megvizsgáljuk a kettős mutáció hatásait. Ebből a célból M. smegmatis mc2155 recX szimpla és recArecX kettős mutáns törzseket hoztunk létre. Kontrollként a közvetlen összehasonlítás érdekében újraértékeltük a recA deléció hatását az M. smegmatisban. A rekombinációs módszerrel, amely a M. tuberculosis és a M. bovis BCG28 számára kifejlesztett protokollon alapul, az M. smegmatis mc2155 ΔrecA és ΔrecAΔrecX mutánsokat 3,279 kb és 3,302 kb lineáris ΔrecA::hyg és ΔrecAΔrecX::hyg AES konstrukciók segítségével hoztuk létre. A megfelelő plazmidok EcoRV-vel történő restrikciós emésztésével körülbelül 100 ng lineáris AES DNS-fragmentumot hoztunk létre (3A ábra). Ezeket kompetens M. smegmatis mc2155:pJV53 rekombináló sejtekbe transzformáltuk70. A ΔrecX és ΔrecAΔrecX mutánsok esetében 4-5 napos inkubáció után 8-10 Hyg-rezisztens kolóniát találtunk. A feltételezett mutáns törzseket PCR segítségével vizsgáltuk annak megállapítására, hogy a recX és recArecX gének törlődtek-e a kromoszómáról (az adatok nem láthatóak). A megfelelő mutánsokat 7H10 Middlebrook agar táptalajon növesztettük 5-8 generáción keresztül, hogy lehetővé tegyük a pJV53 elvesztését.
M. smegmatis mc2155 ΔrecX és ΔrecA ΔrecX mutáns törzsek izolálása. (A) Az M. smegmatis recA recX, ΔrecAΔrecX és ΔrecX régiók fizikai térképe. A két végén nyílhegyekkel ellátott vízszintes vonalak a vad típusú, ΔrecA ΔrecX és ΔrecX törzseknek megfelelő NdeI és SalI restrikciós helyek közötti genomiális DNS fragmentum méretét jelölik. A villám szimbólumok a jelzett restrikciós enzimek felismerőhelyeit jelölik. A kis fekete dobozok (az NdeI felismerőhely mellett) a Southern blotting kísérletekben használt hibridizációs szondákat jelölik. (B) A vad típusú és ΔrecX törzsek genomiális DNS-ének Southern blot analízise. 1. és 4. sáv, molekulasúly markerek; 2. sáv, a vad típusú törzs genomi DNS-e; 3. sáv, a ΔrecX törzs genomi DNS-e. (C) Southern blot analízis a vad típusú és a ΔrecAΔrecX törzsek genomiális DNS-éből. 1. sáv, molekulasúly markerek; 2. sáv, a vad típusú törzs genomi DNS-e; 3. sáv, a ΔrecAΔrecX kettős mutáns törzs genomi DNS-e.
Genotípusos és fenotípusos elemzés az M. smegmatis ΔrecX és ΔrecAΔrecX mutánsok vizsgálata
A PCR-szűrést követően az M. smegmatis mc2155 egyenként 2 darab ΔrecX és ΔrecAΔrecX knockout mutánsát nyertük. A ΔrecX és ΔrecAΔrecX mutánsokat restrikciós enzimtérképezéssel és Southern blot hibridizációval jellemeztük (3. ábra). A megfelelő radioaktívan jelölt szondákkal történő hibridizáció során a vad típusú M. smegmatis mc2155 sejtek esetében egy 4,1 kb-os fragmentumot láttunk. A ΔrecX és ΔrecAΔrecX mutánsok esetében a prediktált 3,14 kb és 2,09 kb fragmentumokat figyeltük meg (3B,C ábra). Mindkét sáv kisebb, mint 4,1 kb, ami azt jelzi, hogy a recX és recArecX gének allélcserével törlődtek. Az allélcsere gyakorisága a recX és recArecX tekintetében 70%, illetve 80% között volt.
Az elemzés egyik fenntartása, hogy a ΔrecX és ΔrecAΔrecX mutációk megfigyelt hatásai a hígromicin-rezisztencia gén inszerciójának poláris hatásaiból eredhetnek. Általánosságban elmondható, hogy a recA-recX lókusz körüli genetikai változások poláris hatásokat eredményezhetnek a recA-recX lókuszt követő gének expressziójára. Két független kísérletet végeztünk a lehetséges poláris hatások vizsgálatára. Először a ΔrecX és ΔrecAΔrecX mutánsokat kiegészítettük a recA és recX gének funkcionális kópiáival. A transzformánsokat a standard táptalajban való növekedési képességük és a mutáns sejtek UV-sugárzással szembeni védelmének szempontjából értékeltük. A tízszeres sorozathígításokat 7H10 agarlemezekre fújtuk és elemeztük. Amint a 4A,B ábrán látható, a vad típusú recA részben kiegészítette a ΔrecA és ΔrecAΔrecX mutáns törzseket, amint az a növekedés támogatására és az UV-sugárzással szembeni védelemre való képességükből következett. A vad típusú recX azonban nem mentette meg a ΔrecAΔrecX mutáns törzsek UV-sugárzással történő DNS-károsodás indukciója során megfigyelt fenotípusát. Mivel a recX deléciója nem volt észrevehető hatással a növekedésre normál és DNS-károsító körülmények között, a ΔrecX és a megfelelő komplementált törzs a vad típusúhoz hasonló növekedést mutatott.
A higromicinrezisztencia gén beillesztése a M. smegmatis mc2155 recA-recX lókuszába nem fejt ki poláris hatást. A precA és precX a pVV16-vektort jelöli, amely a recA vagy a recX gén egy-egy funkcionális példányát hordozza a Hsp60 konstitutív promóter kontrollja alatt. Az EV a pVV16 üres vektort jelöli. precA és precX a M. smegmatis recA és recX gének vad típusú kópiáit hordozó plazmidokat jelöli. Ezeket a jelzett vad típusú és mutáns törzsekbe transzformáltuk. Az M. smegmatis mc2155ΔrecA ΔrecX és ΔrecX mutáns törzsek komplementálása aerob növekedés (A panel) és UV-sugárzással szembeni érzékenység (B panel) tekintetében az M. smegmatis recA vagy recX vad típusú alléljait hordozó plazmidokkal. (C), a M. smegmatis mc2155 vad típusú és mutáns törzsek recA-recX lókusz körüli génjeinek kvantitatív valós idejű PCR-analízise. A hibasávok a 3 független ismétlésből számított átlag standard hibáját jelölik. A szignifikáns különbségeket ns, nem szignifikáns jelzi.
Második lépésként két M. smegmatis mc2155 gének, a gluD (MSMEG_2725) és a glnH (MSMEG_2726), amelyek a recA recX lókusz után helyezkednek el a ΔrecA ΔrecX és ΔrecX mutáns törzsekben a vad típusú törzshez képest. Pozitív kontrollként a recA-recX lókusz előtt elhelyezkedő M. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720) gént használtuk. A teljes RNS-t a vad típusú, ΔrecA ΔrecX és ΔrecX mutáns törzsekből állítottuk elő. A gének transzkriptumainak relatív abundanciáját kvantitatív RT-qPCR segítségével határoztuk meg, és a konstitutívan expresszálódó kromoszómális 16S rRNS génhez normalizáltuk. Az expressziós szinteket a késői exponenciális növekedési fázisban növesztett sejtekből mértük. Minden esetben mind az upstream, mind a downstream ORF-ek génexpressziós profilja hasonló volt a vad típusú és a mutáns törzsek esetében (4C. ábra). Összességében ezek az eredmények kizárják annak lehetőségét, hogy a hígromicin-rezisztencia gén inszerciója poláris hatásokat okoz.
A M. smegmatis ΔrecA és ΔrecA ΔrecX mutáns törzsek a vad típusú törzshez képest károsodott növekedést és csökkent sejthozamot mutatnak
A M. smegmatis ΔrecA és ΔrecA ΔrecX mutáns törzsek jellemzésére a vad típusú törzshez viszonyítva
A M. smegmatis ΔrecX és ΔrecA ΔrecX mutáns törzsek jellemzésére a vad típusú és a knockout törzsek növekedési profilját mértük 7H9 Middlebrook-lében 37 °C-on (5. ábra). A recX deléciónak nem volt érzékelhető hatása (a vad típusú törzshez képest) a M. smegmatis növekedésére. Hasonló körülmények között a recA deléció jelentősen megnövelte a lag fázis hosszát és ezzel párhuzamosan csökkentette az exponenciális növekedési fázist, ami arra utal, hogy a recA szerepet játszik az M. smegmatis növekedésében és életképességében. Továbbá ezek az eredmények összhangban vannak a RecA ismert funkciójával a megrekedt vagy összeomlott replikációs villák mentésében71,72,73. Mivel a recA és a recX gének egyetlen operont alkotnak, megvizsgáltuk a deléciójuk hatását az M. smegmatis növekedésére. A ΔrecA ΔrecX knockout törzs olyan növekedési fenotípust mutatott, amely köztes volt a ΔrecA mutáns és a vad típusú törzs között; azonban a növekedés a késői log és a stacionárius fázisban hasonló volt a ΔrecA és a vad típusú törzsekéhez.
A M. smegmatis mc2155 vad típusú, ΔrecA és ΔrecA ΔrecX és ΔrecX törzsek növekedésének kinetikája normál növekedési körülmények között. Minden adatpont három független kísérlet átlaga, a hibasávok az átlagértékek standard eltéréseit jelölik.
A recA, de nem a recX deléciója érzékenyebbé teszi az M. smegmatist a DNS-károsítókkal szemben
A többi eubaktériumhoz hasonlóan a mikobakteriális RecA fehérje döntő szerepet játszik a DNS-károsodásra adott SOS-válasz szabályozásában74,75,76,77 . Annak vizsgálatára, hogy a recArecX és a recX hiánya befolyásolja-e az M. smegmatis károsodott DNS hatékony javítására való képességét, a mutánsokat különböző DNS-károsító mechanizmusú ágenseknek tettük ki. Ezekben a kísérletekben a baktérium növekedésének exponenciális fázisában (OD600 0,6) a ΔrecA, ΔrecX és ΔrecA ΔrecX mutáns törzsek UV-sugárzásnak, MMS-nek, H2O2-nek vagy ciprofloxacinnak való kitettségével stresszt idéztünk elő. 3 órás inkubáció után a sejteket mostuk, és életképességüket úgy vizsgáltuk, hogy a tenyészetek tízszeres sorozathígításait higromicint (100 µg/ml) tartalmazó Middlebrook 7H10 agar lemezekre foltoztuk. A DNS-károsító szerek legmegfelelőbb koncentrációját/dózisát a törzsek közötti sejtéletképességben mutatkozó különbségek értékelése után határoztuk meg a lemezes vizsgálatok segítségével. DNS-károsító szerek hiányában valamennyi törzs hasonló szintű sejtéletképességet mutatott (6. ábra). Ezzel szemben a DNS-károsító szerek jelenlétében a ΔrecA törzs kifejezett növekedési hibát mutatott, amely a vad típusú törzshez képest a lemezképzési hatékonyság 100-szoros csökkenésével járt együtt. Ez a fenotípus összhangban van a rendelkezésre álló irodalommal. Ezzel szemben az UV, az MMS vagy a ciprofloxacin, de nem a H2O2 letális hatását részben blokkolta a recX gén deléciója a ΔrecA törzsben. Bár a H2O2-hatás hiányának oka nem világos, az alkalmazott koncentráció valószínűleg nem volt elég magas ahhoz, hogy befolyásolja a növekedést. Érdekes módon a ΔrecX törzs mind a négy DNS-károsító anyaggal szemben kissé ellenállóbb fenotípust mutatott, mint a ΔrecA ΔrecX törzs, ami a recX gén elvesztése miatti lehetséges funkciónövekedésre utal. Ezen eredmények alapján nyilvánvaló, hogy a recA aktív szerepet játszik az SOS-válaszban, és hogy a DNS-károsító ágensekkel szembeni érzékenység kissé elnyomott a ΔrecX törzsben.
DNS-károsító szerek hatása a M. smegmatis mc2155 vad típusú és ΔrecA, ΔrecA ΔrecX és ΔrecX törzsek túlélésére. A lemezeket a következőknek tettük ki: (A) 5 J/m2 UV-fény; (B) 0,01% MMS; (C) 1 mM H2O2 és (D) 5 μM ciprofloxacin. A kontroll a DNS-károsító szer nélküli törzsek növekedését jelenti. Az eredmények három független kísérlet reprezentatív adatai (n = 3).
Túlélés különböző koncentrációjú DNS-károsító szerekkel történő kezelés után
A mikobaktériumokat számos kedvezőtlen stresszhelyzet, például oxidatív, táplálkozási és gyógyszer okozta stressz éri78,79,80,81,82 . A sejtek életképessége közötti különbségek további feltárása érdekében olyan kísérleteket végeztünk, amelyekben a sejtek életképességét kolóniaképző egységekkel (CFU) mértük. Először a M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX és ΔrecAΔrecX mutánsok életképességét vizsgáltuk a vad típuséval összehasonlítva, növekvő MMS-koncentrációkkal való megterheléssel. A törzseket a jelzett MMS-koncentrációk jelenlétében növesztettük, amíg a tenyészetek el nem érték a 0,6 OD600 értéket. A sejtek életképességét úgy vizsgáltuk, hogy előre meghatározott számú sejtet ültettünk 7H10 agar lemezekre. A sejteket akkor ítéltük élőnek, ha képesek voltak osztódni és kolóniákat képezni. A mutánsok a vad típusú törzzsel ellentétben koncentrációfüggő módon fokozott érzékenységet mutattak az MMS-re. A mennyiségi elemzés azt mutatta, hogy a ΔrecA mutáns viszonylag nagyobb érzékenységet mutatott az MMS-re, amely az MMS növekvő koncentrációjával nőtt (7A. ábra). A ΔrecX esetében a sejtek ~2-szer kevésbé voltak érzékenyek az MMS-re a ΔrecA sejtekhez képest. Másrészt a ΔrecA ΔrecX mutáns a ΔrecX mutánssal ellentétben nagyobb érzékenységet mutatott az MMS-re. A ΔrecX mutáns MMS-re való érzékenysége arra utal, hogy a recX-nek a RecA mellett még nem azonosított célpontjai is lehetnek. Ez a feltételezés további vizsgálatot igényel.
DNS-károsító szerek növekvő koncentrációinak széles skálájával kitett exponenciális fázisú kultúrák túlélése. A M. smegmatis vad típusú, ΔrecA, ΔrecA ΔrecX és ΔrecX törzsek túlélését a CFU-k számának meghatározásával vizsgáltuk. (A) Az (A), MMS; (B) H2O2; (C) UV-sugárzással és (D) ciprofloxacinnal kezelt sejtek túlélése. A hibasávok a 3 független ismétlésből számított átlag standard hibáját jelölik. A szignifikáns különbségeket *p < 0,05; **p < 0,01 és ***p < 0,001 jelzi. ns, nem szignifikáns.
A továbbiakban a M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX és ΔrecA ΔrecX mutáns törzseknek a vad típusú törzshez viszonyítva úgy határoztuk meg, hogy növekvő H2O2-koncentrációnak tettük ki őket. Az eredmények azt mutatják, hogy a ΔrecA mutáns kevésbé volt érzékeny erre a kezelésre (7B. ábra). A recX deléciója önmagában, vagy a recA-recX lókusz deléciója csak csekély hatással volt a mutáns sejtek életképességére és proliferációjára a H2O2 kezelés hatására. Figyelemre méltó, hogy a ΔrecA és ΔrecAΔrecX mutáns törzsek UV-sugárzásra és ciprofloxacinra szignifikánsan sokkal súlyosabb növekedési fenotípust mutattak, mint MMS-re vagy H2O2-re (7C,D ábra). Továbbá a ΔrecA törzs nagyobb érzékenységet mutatott az UV-sugárzással és a ciprofloxacinnal szemben, mint a ΔrecA ΔrecX kettős mutáns törzs.
A recA és recX gének expresszióját DNS-károsodás indukálja
A recA gén előtt elhelyezkedő szabályozó elemek nem konzerválódnak minden mikobaktériumfajban. Az M. tuberculosis recA génje például két promóterről íródik át: mindkettő DNS-károsodás által indukálható, bár különböző mechanizmusokon keresztül. Az M. tuberculosis recA P1 promótere (a startkódontól proximálisan) a LexA és RecA fehérjéktől függetlenül indukálható DNS-károsodást követően. Ezzel szemben a P2 promótert (amely a recA startkódontól távolabb található) a LexA szabályozza, amely funkcionálisan analóg az E. coli recA promóterével83,84,85 . Érdekes módon a DNS-károsodás indukciójának mechanizmusa az M. tuberculosisban nem teljesen konzerválódott az M. smegmatisban46,75. Ezek az eredmények hangsúlyozzák annak szükségességét, hogy megértsük az M. smegmatis recA és recX gének expresszióját és szabályozását, valamint a DNS-károsító ágensekre adott válaszreakcióban betöltött szerepüket.
A fent leírtak szerint a hipoxia az M. smegmatis recA és recX gének expressziójának növekedését okozta (1. ábra). Annak további alátámasztására, hogy az M. smegmatis recA és recX gének expressziója károsodás által indukálható, RT-qPCR segítségével meghatároztuk az indukció kinetikáját DNS-károsodással és anélkül. Teljes RNS-mintákat készítettünk a 0, 3, 6, 9 és 12 órával az UV-fénynek való expozíciót követően, valamint a kezeletlen kultúrákból származó M. smegmatis sejtekből, és a Módszerek részben leírtak szerint elemeztük. Az eredmények nem mutattak szignifikáns különbséget a recA és recX transzkriptumok szintje között a kezeletlen sejtekben. Ezzel szemben a recA és recX mRNS-transzkriptumok jelentős növekedése volt megfigyelhető 3 órával az UV-sugárzásnak való kitettség után, majd ezt követően kissé csökkent. Az RT-qPCR adatok összehasonlítása jelentős különbségeket jelez a recA és recX transzkript szintek között. Az UV-sugárzásnak való kitettség a recA mRNS ~8-szoros növekedését eredményezte a kontrollhoz képest, míg a recX ~3-szorosát (8A,B ábra). Így, bár a recA és a recX mRNS ugyanabban a transzkripciós egységben létezik, ezek az eredmények azt az elképzelést támasztják alá, hogy a recX mRNS transzkript termelését és/vagy stabilitását egy további poszttranszkripciós szabályozási mechanizmus szabályozza.
UV sugárzás indukálja a recA és recX expresszióját M. smegmatis-ban. (A) a recA mRNS felhalmozódásának kinetikája kontrollban és UV-sugárzásnak való kitettséget követően; (B) a recX mRNS felhalmozódásának kinetikája kontrollban és UV-sugárzásnak való kitettséget követően. (C) Reprezentatív Western blotok, amelyek a RecA és RecX fehérjék felhalmozódásának kinetikáját mutatják kontroll és UV-indukált M. smegmatis sejtekben. (D,E) A C panelen látható Western blot adatok számszerűsítései. A hibasávok a 3 független ismétlésből számított átlag standard hibáját jelentik.
Ezek az eredmények további kísérletek elvégzésére késztettek bennünket, hogy meghatározzuk a RecA és RecX fehérjék felhalmozódásának kinetikáját M. smegmatis sejtekben DNS-károsodással vagy anélkül. Western blotting vizsgálatokat végeztünk teljes sejtlizátumokon a RecA és RecX ellen termelt poliklonális antitestekkel (8C ábra). A Western blotok mennyiségi meghatározása azt mutatta, hogy a sejtek jelentős mennyiségű RecA és RecX fehérjét tartalmaztak a nem indukált sejtekben (8D,E ábra). Összehasonlításképpen, mind a RecA, mind a RecX mennyiségének 2-szeres növekedése (a kontrollhoz képest) volt megfigyelhető a sejtekben 3 órával az UV-sugárzásnak való kitettség után, majd ezt követően csökkent. Fontos, hogy a RecA és RecX fehérjék indukciója a hipoxiás körülmények között lévő sejtekben megfigyelt mintázatra emlékeztetett (2. ábra), bár a DNS-károsító mechanizmusok valószínűleg eltérőek.
Záró megjegyzések
Számos vizsgálat bizonyította, hogy a recA és recX a DNS-javítással és rekombinációval kapcsolatos funkciók széles skáláját látja el7,10 . Tudomásunk szerint a M. smegmatis recA és recX génjeinek expresszióját aktiváló ingereket nem azonosították. Ebben a vizsgálatban e gének expressziós szintjét vizsgáltuk aerob növekedésű sejtekben és különböző stresszkörülményekre adott válaszként. A M. smegmatisban, sok baktériumfajhoz hasonlóan, a recA és a recX ugyanahhoz az operonhoz tartozik, és a recX gén közvetlenül a recA gén után helyezkedik el, és átfedő kódoló régiókkal rendelkezik86. Megállapították, hogy a DNS-károsító ágensek eltérő mértékben indukálták mindkét gén expresszióját; az expressziós arányok azonban hasonló mintázatot követnek. Érdekes módon mind a RecA, mind a RecX szintje magas marad stressz körülmények között az aerob növekedési körülményekhez képest.
Más vizsgálatok is kimutatták a recX alternatív szerepét a RecA által elősegített rekombinációs DNS-javításban. Míg a RecX fehérje fizikailag kölcsönhatásba lép a RecA-val, és az utóbbi minden ismert funkciójának erős gátlójaként működik számos baktériumfajban14,46,48, addig N. gonorrhoeae-ben és B. subtilisben25,26 a homológ rekombinációt erősíti. Hogy betekintést nyerjünk a recX stresszválaszban betöltött szerepébe a mikobaktériumokban, a M. smegmatis recX és recArecX knockout mutánsait állítottuk elő. Érdekes módon a recX deléciója az M. smegmatisban mind a négy DNS-károsító ágenssel szemben kissé ellenállóbb fenotípust eredményezett, ami a recX gén elvesztése miatti lehetséges funkciónövekedésre utal. Ennek a hatásnak a molekuláris alapja nem világos, amit érdemesnek tűnik a jövőbeni vizsgálatok során feltárni. Bár elemzésünk elsősorban a recA és a recX közötti genetikai kölcsönhatásra összpontosított a rekombinációs DNS-javítási útvonalban, érdekes módon úgy tűnik, hogy a recX fontos szerepet játszik a baktériumok növekedésében. Összefoglalva, ezek az eredmények összhangban vannak azzal az elképzeléssel, hogy a M. smegmatis recX fontos szerepet játszik a DNS-javítási/rekombinációs folyamatokban kedvezőtlen körülmények között, talán az eddig ismeretlen gének egy részhalmazának káros hatásait szabályozva.
A használt rövidítések:
DTT, ditiotreitol; EDTA, etiléndiamin-tetraecetsav; kb, kilobázis; MMS, metilmetán-szulfonát; ODN, oligonukleotid; PAGE, poliakrilamid gélelektroforézis; PVDF, polivinilidén-difluorid membrán; RT-qPCR, reverz transzkripciós kvantitatív polimeráz láncreakció; SDS, nátrium-dodecil-szulfát; ssDNS, egyszálú DNS; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M nátrium-citrát (pH 7,0) puffer.