Az SMN2 ellen irányuló antisense oligonukleotidok
Az ASO-k egyszálú nukleinsavak, amelyeket úgy szintetizálnak, hogy komplementárisak legyenek egy cél-RNS-szekvenciához. A beadást követően az ASO egy még kevéssé meghatározott endocitikus mechanizmuson keresztül kerül a sejtbe, majd belép a sejtmagba, ahol a célpont pre-mRNS-éhez kötődik.62 Kezdetben az ASO-kat a génexpresszió elnyomására használták, vagy az RNS-célpont transzlációjának blokkolásával, vagy annak degradációjának elősegítésével. Manapság az ASO-kat úgy is megtervezhetik, hogy megváltoztassák a célpont feldolgozását vagy splicingjét. Az SMA terápiás ASO-kat úgy tervezték, hogy az SMN2 pre-mRNS módosított splicingjét úgy módosítsák, hogy a 7. exon bekerüljön a végső feldolgozott transzkriptumba. Amint azt a korábbi fejezetekben tárgyaltuk, az SMN2 egy C-T átmenetben különbözik az SMN1-től, amely hat nukleotiddal a 7. exonban következik be (a két szekvencia között más különbségek is vannak, de funkcionálisan ez a legfontosabb). A C-T átmenet egy kiterjesztett gátló kontextust hoz létre a 7-es exonban (más néven “Exinct”).63 Mivel a 7-es exon egyébként gyengén definiált a gyenge 5′-splice-hely miatt, az SMN2-ben a C-T mutáció elegendő ahhoz, hogy az egyensúlyt a felvételről a kizárásra billentse.
A splicing szabályozó elemek fontos szerepet játszanak annak meghatározásában, hogy a sejt splicing gépezete mely helyeket ismeri fel. A releváns SMN2 elemek helyét és funkcióját az SMN2 szekvenciájának progresszív iteratív módon történő kiegészítésére tervezett ASO-k kiterjedt sorozatának splicing hatásának elemzésével azonosították.63-66 Az intronikus splicing silencer ISS-N1-et ezzel a módszerrel nagyon erős silencing elemként azonosították; a motívum a 7. exon 5′-splicing site-ja után található, és a splicing represszor hnRNP A1-hez kötődik.66-68 Az ASO-kat úgy tervezték, hogy az ISS-N1 vagy más szabályozó elemek megcélzásával megbízhatóan indukálják az exon 7 beépülését.
Az ASO-kat úgy is lehet tervezni, hogy bifunkcionálisak legyenek. Például kimerikus ASO-k, amelyek az SR rekrutációs doméneket (RS peptid) egy antisense szekvenciával olvasztják össze, amely elnyomja a silencer motívumokat, kimutatták, hogy növelik az exon 7 beépülést és az SMN fehérje szintjét beteg fibroblasztokban; a bifunkcionális ASO egyetlen injekciója képes volt SMN fehérjét indukálni újszülött egerek agyában és meghosszabbította az élettartamot.65,69 Ezt az ESSENCE (exon-specifikus splicing enhancement by small chimeric effectors) néven ismert ASO tervezési stratégiát kezdetben az SMA terápiájában követték, de későbbi vizsgálatok kimutatták, hogy az RS peptid nem szükséges az SMN2 exon 7-es beépülésére gyakorolt erőteljes hatás eléréséhez. Mivel a kimérikus megközelítés nehézségeket okoz az ASO előállításában, és korlátozza az ASO sejtáteresztő képességét, a bifunkcionális ASO-kat nem tesztelték széles körben egereken, és jelenleg klinikai fejlesztés alatt sem állnak.62
Miután az ISS-N1-et célzó ASO-król bebizonyosodott, hogy figyelemre méltóan hatékonyak az exon 7 beépülésének elősegítésében, a következő stratégiai kérdés annak meghatározása volt, hogy melyik ASO gerinc lenne a legjobb egy lehetséges SMA terápiában. Az ASO-t alkotó oligonukleotidokat általában módosítják az olyan gyógyszerészeti tulajdonságok optimalizálása érdekében, mint a sejtfelvétel, a toxikológia, a farmakokinetika és a célponthoz való kötődés. Egy közös adaptáció, amely a Ciba-Geigy Ltd. együttműködéséből jött létre. (ma Novartis) és az Isis Pharmaceuticals (ma Ionis Pharmaceuticals) együttműködéséből született, a 2′-O-metoxietil (2′-MOE), amely növeli mind az ASO nukleáz lebontással szembeni ellenállását, mind a hibridizációs affinitást.70 A 2′-MOE oligonukleotidok rágcsálókon és főemlősökön, beleértve az embert is, nagyon biztonságosnak bizonyultak.62 Az ISS-N1-et blokkoló 2′-MOE ASO adagolása sikeresen növelte az SMN2 7-es exonját dózis- és időfüggő módon SMA egerekben, javítva a neuromuszkuláris patológiát és drámaian növelve a túlélést.68,71,72 Az Ionis Pharmaceuticals a Biogen céggel együttműködve egy 2′-MOE ASO terápiát fejleszt nusinersen (más néven IONIS-SMNRx, korábban ISIS-SMNRx) néven. A nusinersen preklinikai vizsgálatai főemlősökön azt mutatták, hogy egyetlen intratekális injekció az exon 7 beépülésének jelentős javulásához szükséges szöveti koncentrációkat eredményezhet, és ezek a koncentrációk több hónapon keresztül fennmaradtak.62 A gyógyszer hosszú felezési ideje azt jelenti, hogy a betegeknek csak néhány havonta van szükségük intrathecális injekcióra.73 A 2-14 éves SMA II/III típusú betegeken végzett 1. fázisú nyílt vizsgálatban a nusinersen egyszeri injekciója jól tolerálható volt, és úgy tűnik, hogy a legmagasabb dózisban a HFMSE-pontszámok emelkedésével korrelált.74 2015 júniusában az Ionis új adatokat tett közzé a nusinersen I. típusú csecsemőkön végzett, folyamatban lévő nyílt, 2. fázisú vizsgálatából, amelyek azt mutatták, hogy a csecsemők tovább éltek és több motoros mérföldkövet értek el, mint ami a betegség természetes lefolyása alapján általában elvárható lenne.75 Emellett a gyógyszer hatásmechanizmusát alátámasztották azok az adatok, amelyek a teljes hosszúságú SMN2 mRNS és SMN fehérje mennyiségének növekedését mutatták a kezelt betegek boncolásából származó agy- és gerincvelőszövetekben. Az Ionis közzétette a II/III-as típusú SMA-ban szenvedő gyermekeken végzett 2. fázisú, nyílt kiterjesztésű vizsgálatának adatait is, amelyek szerint a vizsgálati alanyok 57%-a legalább hárompontos javulást ért el a HFMSE-n, és átlagosan 55 m-es javulást a 6 perces gyaloglópróbán (6MWT).76 A nusinersen 3. fázisú vizsgálatai jelenleg SMA-s csecsemőkön és felnőtteken egyaránt folynak (NCT02193074; NCT02292537); az eredmények várhatóan 2017-ben állnak rendelkezésre.
Noha a 2′-MOE SMA terápiában történő alkalmazásával kapcsolatban még nem figyeltek meg biztonsági problémákat, más betegcsoportokban a 2′-MOE ASO-kkal kapcsolatban bizonyos toxicitásokat tapasztaltak.77,78 Egy másik gerincmódosítás, amelyet SMA-ban való felhasználásra vizsgálnak, és amely megkerülheti ezeket a problémákat, a foszforamidát-morfolino oligomerek (PMO-k). A PMO-k hatékonyabbnak bizonyultak a 2′-MOE-nál a Duchenne-izomdisztrófia (DMD), egy másik gyermekkori neuromuszkuláris betegség egérmodelljében, és DMD-s betegek is jól tolerálták őket.79 Az ISS-N1-et kiegészítő morfolino ASO-k ICV-injekciója jelentősen javította az SMA egerek túlélését, központi idegrendszeri (CNS) toxicitás jelei nélkül.80,81,81 Az ISS-E1-re, a 7. exon előtt található intronikus splicing silencerre irányuló morfolino szintén javítja az SMA egerek fenotípusát.82 Ezt a megközelítést még nem vezették be a klinikumba.
Az ASO gerincének kémiai összetétele befolyásolhatja a különböző beviteli módszerekre való alkalmasságot, az ismételt adagolás szükségességét és a kapcsolódó toxicitásokat – mindezek fontos hatással vannak a terápiás alkalmazásra. Ráadásul az SMA kezelésére használt ASO-nak farmakológiailag aktívnak kell maradnia a központi idegrendszer szöveteiben, különösen a motoros neuronokban. A gerinctől függetlenül az SMA terápiájára tervezett bármely ASO-t valószínűleg közvetlenül az agy-gerincvelői folyadékba kell beadni intratekális injekcióval. Bár néhány, újszülött egereken perifériás ASO beadással végzett vizsgálat hatékonyságot mutatott, a vér-agy gát fiatal egereknél még nem alakult ki teljesen, és a perifériásan beadott ASO olyan mértékben képes behatolni a CNS-be, ami embernél nem lehetséges.71 Bíztató, hogy az intrathecálisan beadott ASO-k széles körben eloszlanak a fontos CNS-szövetekben, például a motoros neuronokban, asztrocitákban és mikrogliákban.72,83-85
Bár az intratekális injekció némileg invazív és szedációt vagy altatást igényel, az ASO-k számos jelentős előnnyel rendelkeznek más kísérleti módozatokkal szemben, beleértve a nagy célspecificitást, a figyelemre méltó hatékonyságot, az ASO-k szisztémás adagolásához képest kevés toxicitást és a biológiai szerekhez (de nem a kismolekulákhoz) képest viszonylag egyszerű gyártási folyamatokat. További információk a 18. fejezetben találhatók.