Az Aspergillus fumigatus biofilmképződés szakaszainak elemzése és leírása pásztázó elektronmikroszkópiával

Az Aspergillus fumigatus orvosi szempontból az immunhiányos egyének opportunista kórokozója, a betegség súlyossága a gazdatest immunállapotától függ, és 50-95%-os halálozási arányt mutat. Ez a gomba helyi fertőzéseket okoz, mint például köröm dermatomikózis vagy gombás keratitis, és invazív fertőzéseket, mint például az aspergillózis, és a kórházi betegeknél a gombás fertőzések második leggyakoribb oka. Az A. fumigatus-fertőzés a légutakban tüdőgombás labdát, invazív aszpergillózist, invazív pulmonális aszpergillózist (IPA), túlérzékenységi pneumonitist, asztmát, immunglobulin E-mediált allergiás rhinitist, krónikus nekrotizáló tüdőgyulladást vagy allergiás bronchopulmonális aszpergillózist (ABPA) okozhat. Ezenkívül csontvelőgyulladást és szívbelhártya-gyulladást okoz.

Az A. fumigatus biofilmet fejleszt, amely az egyik legfontosabb virulenciafaktor lehet. Az A. fumigatus biofilm in vitro EMC-be ágyazott micéliumokat dolgoz ki, és biofilmképződést írtak le humán hörgőhámsejtekben (HBE) és cisztás fibrózisos hörgőhámsejtekben (CFBEC), valamint cisztás fibrózisban szenvedő betegeknél . A katétereken és protéziseken kialakuló gombás biofilm hozzájárul a nosokomiális fertőzések kialakulásához. A gombás fertőzések perzisztenciája tehát azért következik be, mert a gomba képes biofilmet képezni a legkülönbözőbb orvosi eszközökön, és mert a perzisztens sejtek a rezisztencia fontos mechanizmusát jelentik. A gazdaszervezetben kialakult biofilmnek kitett terápia általában antimikrobiális szerek toxikus koncentrációjának beadását igényli, és az ajánlott kezelés magában foglalja a fertőzött eszköz eltávolítását; ez azonban nehéz és költséges folyamat. Ezért a gombás biofilmek jelentős klinikai és gazdasági problémát jelentenek .

Az elmúlt évtizedben számos tanulmányt publikáltak az A. fumigatus biofilmjéről, mind in vivo (egérmodellekben, invazív tüdőaszpergillózisban szenvedő betegekben és primer humán epithelialis kultúrákban), mind in vitro (polisztirol lemezeken). Általában ezek a vizsgálatok főként a biofilm érettségi szakaszára és az ECM kémiai összetételére vonatkoznak, a biofilm stádiumairól kevés kép készült, de ezek közül bármelyik leírta a biofilm kialakulásának valamennyi szakaszát. Így az információk eltérnek a munkacsoportunk hozzájárulásaitól .

A tanulmány legfontosabb hozzájárulásai a következők: i) leírást adunk a biofilmképződés minden szakaszáról az A. fumigatus in vitro, az idő múlásával, és a szakaszokat SEM-felvételekkel támasztjuk alá; ii) két különböző eredetű izolátumot elemeztünk: egyet a környezetből, egyet pedig egy szaruhártya-fekélyes betegből; iii) olyan mikrohifákról (klinikai izolátum) és gombaszerkezetekről számolunk be, amelyekről eddig alig számoltak be, és amelyeket tudomásunk szerint az Aspergillus fajok esetében még nem írtak le; és iv) leírást adunk a biofilm-kolonizáció kialakulásának diszperziós lépéséről új pontokon.

Az A. fumigatus érett biofilmjének (24 órás inkubáció 28 °C-on és 37 °C-on) szerkezeti szerveződésének elemzésére két törzset, egy talajból és egy gombás keratitisben szenvedő betegből származó törzset vizsgáltunk SEM-mel. A kutatás során megfigyelt A. fumigatus biofilmképződés áttekintése az volt, hogy ezek a biofilmek hasonlóan viselkedtek, függetlenül attól, hogy az izolátum a talajból vagy a klinikáról származott-e; az inkubációs hőmérséklet szerint azonban különbségek mutatkoztak. 28 °C-on a biofilm a klasszikus mikrobiális növekedésnél leírtakhoz hasonló szakaszokat mutatott: a lag, exponenciális és stacionárius fázisokat; a biofilm növekedése lassú és stabil volt, alacsony ECM-termeléssel, és a gomba szerkezeti szerveződése egyszerű volt (1. ábra). 37 °C-on a teljesítménygörbe meglehetősen változó lag (adaptációs) és log (exponenciális) fázist mutatott, ami a magas hőmérsékleten történő inkubáció miatti stresszre adott válasz lehetett; így 37 °C-on az adaptációs fázis (lag) csökkenése az életképes gomba fenntartása érdekében; továbbá a log fázis, diszkontinuus növekedéssel és mindkét viselkedéssel valószínűleg adaptív válasz . Így 37 °C-on az érési szakaszban rendkívül szervezett micéliumszerkezetek voltak, és ezek redukálódtak és tömörültek a megvastagodott és anasztomózisba olvadt hifákkal, és az ECM bőségesen fedte, körülvette és erősítette a gombaszerkezeteket (ábrák. 3 és 4).

Ebben a tanulmányban az A. fumigatus biofilm stádiumait bizonyítjuk SEM segítségével. A biofilmképződés során megfigyelt szakaszok a következők voltak:

Megtapadás, sejtkoaggregáció és EPS-termelés

A korai szakaszban (2/4 h) a konídiumok a gomba sejtfalának szerkezeti összetevői közötti elektrosztatikus erők kölcsönhatása révén tapadnak a lemez felületéhez, és ez a vonzóerő gyenge, ezért reverzibilis. Az irreverzibilis és tartós kötődést széles körben leírták a sejtfelszínen jelen lévő specifikus bakteriális adhézinok esetében, amelyek kötődnek a szubsztráthoz és az EPS-hez, amelyek a mikroorganizmus által a biofilmképződés kezdeti szakaszában termelt anyagok, amelyek a sejtek egymáshoz és a szubsztráthoz való tapadásában működnek, és fehérje-szénhidrát komplexekből és glikoproteinekből állnak, amelyek elsősorban strukturális vagy adhéziós funkciókat látnak el. Az adhézinek részt vesznek a baktériumsejtek egymás közötti felismerésében, beleértve a hídépítést és a kolóniaképződés elindítását . Az adhézineket a gombák adhéziójában írják le a biofilmképződés során. A Candida albicans, Candida glabrata és Candida tropicalis biofilmekben a biofilmképződésben részt vevő adhéziós gének egy csoportja az agglutininszerű szekvencia (ALS) családba tartozik, amely kulcsszerepet játszik ebben a folyamatban, és olyan fehérjéket kódol, amelyek a sejtfelszíni adhézin glikoproteinek jellemzőivel rendelkeznek. A C. albicansban jelen lévő ALS család nyolc gént (ALS1-ALS7 és ALS9) tartalmaz, amelyek számos felszíni glikoproteint kódolnak . Az A. fumigatusban hat hidrofobint azonosítottak a konídiumok felszínén, amelyek a RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp és RodFp rudakat tartalmazzák. Ez a hidrofób tulajdonság lehetővé teszi a gazdasejtek fehérjéihez való tapadást, és részt vehetnek a polisztirollemez felszínéhez való tapadásban és a biofilmképződés folyamatának elindításában az összes vagy csak két-három ilyen . Továbbá, Gravelat és munkatársai leírták ezt a gomba kölcsönhatást, és megállapították, hogy az adhézin MedA szabályozza a polisztirol lemezhez való tapadást, a biofilmképződést és a konídiumképző gének expresszióját, és hogy keményen befolyásolja a konídiumképződés folyamatát A. fumigatusban . A gomba adhézinok és a lemezfelület közötti kölcsönhatásból eredő adhézió és a konídium-konídium adhézió valószínűleg jelátvitelt vált ki, és elősegíti a sejtek koaggregációját és EPS-termelését, és ezeket az eseményeket a 2. ábra mutatja be (4 h). Ugyanakkor az EPS a sejtek szoros kötődése révén felgyorsítja a gombakolóniák kialakulását (2. ábra (8-12 h)) .

A konídiumok hifává csírázása és fejlődése

A biofilm kialakulásához a sejtek küszöbértékének megfelelő számú sejtre van szükség, hogy érzékelhetővé váljanak és választ generáljanak, ami a specifikus funkciójú génexpresszió szabályozási mechanizmusa . Az A. fumigatus biofilmképződésében a konídiumcsírázás megkezdése előtt a konídiumok felülete kifejezetten hidrofób, és 40 %-ban hidrofób metilcsoportokból áll. Az A. fumigatus konídiumok csírázása a hidrofób fehérjeszerű pálcikaréteg megbontását eredményezi, és feltárja a belső konídiumfalakat, amelyek alapvetően poliszacharidokból állnak, amelyek hidrofil sejtfal-összetevők. Egyetlen csírázó spórán egy hidrofób csúcs található. A konídium fokozatosan elveszíti felületi hidrofób jellegét, és ezt követően az új növekedési pont hidrofób pálcikák és hidrofil poliszacharidok együttes jelenlétét mutatja. A konídiumok hifákká csírázása a 2. ábrán látható csíracsövek kialakulásával kezdődik (8-12 h), amelyek rendelkeznek a sejtfal nagyon hidrofil jellegével, és várhatóan kedveznek a hifák növekedésének .

Biofilm érés

Az A. fumigatus biofilm érését 24 h alatt figyelték meg, ami hasonló inkubációs idő, mint a más kutatók által közöltek. A szerkezeti összetevők közé tartozik az ECM, amely jelen van az érett biofilmben és megköti a sejteket, hogy a biofilm szerkezeti alapját képezze, beleértve az EPS-t és sok szervezett micéliumot (2. ábra (24 h0) . ECM. A víz alkotja a legnagyobb mennyiségben előforduló komponenst, és a biofilmben közel 97 %. Ebben a nedves környezetben rendezett makromolekuláris hálózat található. Az EPS-nek a baktérium biofilmekben betöltött fő funkciói a következők: adhézió, sejtaggregáció, kohézió; vízvisszatartás, védőgát, mint specifikus gazda védekező vagy antimikrobiális szerek, szerves vegyületek és szervetlen ionok felszívódása, enzimatikus aktivitás, tápanyagforrás, genetikai információcsere, elektrondonor vagy -akceptor, sejtkomponensek exportja, a felesleges energia visszatartásának tárolása és az enzimek stabilizálása . A gombák biofilmjeiben mindezen funkciókat még nem írták le, de néhányat tanulmányoznak: a mátrix kohéziós és adhéziós erői hozzájárulnak a biofilm építészeti és mechanikai stabilitásához. A gombasejtek immobilizálódnak a mátrixban, és egy működő ökoszisztémaként működnek a folyamatosan változó és homeosztatikusan szabályozott intenzív kölcsönhatásokkal, beleértve a sejt-sejt kommunikációt, amely a sejteket összetartó ragasztóanyagként működik . A biofilm szerkezete nagymértékben változik az azt előállító mikroorganizmus és a mikroélőhelyeit körülvevő körülmények szerint, beleértve a klinikai megjelenéshez kapcsolódó szerkezeti különbségeket is. A fertőző folyamatok során az ECM támogatja a gazdaszervezettel szembeni védelmet, valamint a mikroorganizmusok gyógyszerekkel szembeni ellenállását; így az ECM nemcsak mechanikai keret, hanem a sejtek viselkedésének szabályozója is. A mátrix hidrofób fehérjéi kötődnek a specifikus sejtfelszíni receptorokhoz, amelyek a sejt-mátrix adhéziót eredményezik, ami hatást gyakorol a sejtek alakjára, migrációjára, proliferációjára, a sejtek túlélésére és metabolizmusára. Ezenkívül az ECM védi a sejteket a környezeti hatásoktól, beleértve a kiszáradást, az ultraibolya (UV) sugárzást, az oxidációt, az éhezést, a ragadozók és a gazdaszervezet immunvédelmének hatását és az antibiotikumokat . Az ECM jellemzői a 2. ábrán (24 h) és a 3. ábrán láthatóak voltak, és a gombahifákhoz egy összefüggő burokká tapadtak, valamint pórusos állagúak voltak (2. ábra (24 h)). Az A. fumigatus biofilmben az EPS nagymértékben strukturálisan elrendeződött és bőséges termeléssel rendelkezett, amely fedte, körülvette és erősítette a gombaszerkezeteket; kohéziós anyagként működik a hifa-hifa szerkezetek összeolvadásához (csak 37 °C). Az EPS nyálkás megjelenéssel jelentkezik, amely teljesen megtapad és befedi a hifákat, anasztomózist okoz és lezárja a vízcsatornák lumenét (2. ábra (24 h), 3. és 4. ábra). Korábbi tanulmányainkban munkacsoportunk leírta az A. fumigatus biofilm érési szakaszát, amelyben hasonló struktúrákat figyeltek meg .

Egyes mikrokonzorciumokban az EPS kémiai összetétele ismert (többek között szénhidrát polimerek, DNS és/vagy fehérjék és, lipidek), de másokat még nem sikerült azonosítani. Az A. fumigatus’-felület α-1,3-glükánokból, kitinből, kitozánból, galaktomannánból, galaktozaminogalaktánból, melaninból és fehérjékből áll. A sejtfal összetétele és szerkezeti szerveződése folyamatosan átrendeződik; bár a jelen lévő poliszacharidok azonosak, mennyiségük és lokalizációjuk a növekedési feltételek és a táplálkozási környezet függvényében változik. A következőkben bemutattuk az A. fumigatus biofilm kémiai összetételét, amelyet a kitinhez, a metabolikus aktivitáshoz és a nukleinsavakhoz kötött fluorokrómok CLSM segítségével történő együttes lokalizációjával figyeltünk meg; ezen kívül a fluorokróm jelek átfedését figyeltük meg, amikor ezek közül kettőt vagy hármat csatoltak (5. ábra). A poliszacharidok, például az α 1,3-glükánok esetében leírt funkció magában foglalta, hogy in vitro meghatározó szerepet játszanak a hifák aggregációjában és a biofilmekben történő hifaaggregációban. Az ECM más poliszacharidjai, köztük a galaktomannán és a galaktozaminogalaktán szintén ismert, hogy szerepet játszanak a gomba védelmében és a biofilm struktúráinak felületekhez való tapadásában . Az extracelluláris DNS (eDNS) az ECM biofilm fontos összetevője, amely fenntartja az A. fumigatus szerkezeti és építészeti integritását. Az eDNS autolízis útján jön létre, és jelentősen összefüggésbe hozták a gombaellenes rezisztencia szintjével (5. ábra). Az eDNS továbbá a horizontális géntranszfer géntartalékává válhat. A DNS szilárdabb és ellenállóbb szerkezeti szerveződést kölcsönöz, ha poliszacharidokkal együtt lokalizálódik. az eDNS a gombasejtekből származik, mivel az A. fumigatus kitinázok szekréciója kedvez a felszabadulásának (5. ábra) . A biofilmben a sejtfal-módosítás alapvető hatást gyakorol a sejtfal-gyógyszerekkel szembeni rezisztenciára. Az A. fumigatusban, egy egér biofilm modellben, a multidrog-rezisztens (MDR) efflux pumpa AfuMDR4 génekben az antimikrobás szerek kibocsátásával összefüggő gént jelentősen indukálta a Voriconazol kezelés 24 óra után . A FUN1 marker olyan metabolikus aktivitást mutatott ki, amely élő közösséget jelent (5. ábra).

micéliumok: A biofilm komplex 3-dimenziós (3-D) szerkezetet mutat, amely egy összehangolt sejtfolyamatot tükröz; a micélium fejlődése és terjeszkedése nyilvánvaló volt, amely mindkét hőmérsékleten tömörített hifa-réteghálózatokat, hifa-hifa adhéziót, anasztomózist tartalmazott, optimális térbeli elrendeződéssel kialakított csatornákkal, amelyek biztosítják a tápanyagok beáramlását és a salakanyagok kiáramlását, és így stabilizálják a biofilmet; 37 °C-on ez a csatorna sokkal nyilvánvalóbb volt (ábra. (24 óra), 3. és 4.). Ezenkívül ezeket a struktúrákat más kutatók is megfigyelték . Mikrohifák: A biofilm érésének korai szakaszában a klinikai izolátumban szabálytalan gombaszerkezeteket, például mikrohifákat figyeltek meg (4. ábra). Ez a tény azért fontos, mert a szakirodalomban kevés utalás van a mikrohifákra, és ez az első alkalom, hogy A. fumigatusban leírták őket. A mikrohifák olyan citoszkeleton-változásokat mutatnak, amelyek rövid és karcsú, vékony falú, hajlított végű hifákat hoznak létre. A mikrohifák magas enzimatikus aktivitással társulnak, ami kedvez az érési folyamatnak és az azt követő biofilm stádiumú sejtdiszperziónak.

Celladiszperzió

A sejtdiszperzió során a biofilm egy része leválik, a konídiumokat vagy hifákat tartalmazó rész. Aszinkron biofilmfejlődést figyeltünk meg, különösen a biofilm-érlelési szakaszban, amikor az új konídiumok képesek voltak csírázni, új micéliumnövekedést és hifamódosulásokat, például fürtöket létrehozni (4. és 6. ábra). A biofilm sejtdiszperziója a környezeti változásokra reagálva következik be. Ez úgy hat, hogy eltávolítja a veszélyes anyagot a biofilm főtestéből. Ez a folyamat a bent lévő biofilmsejtek új helyen történő szétszóródásához és szaporodásához vezet, amelyet komplex molekuláris események támogatnak . A biofilmek az alatta lévő élő sejtek védőburkának tekinthetők, rendkívül összetett és számtalan funkcióval, és így ezek valóban figyelemre méltó biológiai konstrukciók. A biofilmek védelmet nyújtanak a ragadozókkal vagy kémiai támadásokkal szemben, és a belső sejtek számára közeget biztosítanak az intracelluláris kommunikációhoz, a tápanyagáramláshoz és a genetikai anyag átviteléhez. A sejtek szétszóródása életképes sejteket juttat el a környezet más pontjaira vagy a gazdaszervezeten belülre, ahol a sejtek szaporodni tudnak, így elősegítve a perzisztenciát. A sejtdiszperzió a szűkös környezeti tápanyagkörülmények következtében következik be, és így ez egy túlélési mechanizmus. Ezért a sejtdiszperzió nemcsak a genetikai diverzitás elősegítése szempontjából fontos, hanem a kedvezőtlen élőhelyekből való menekülés szempontjából is, elősegítve új fülkék kialakulását és a mikroorganizmus új helyen való fennmaradását .

.