Az mRNS átalakítása kétszálú cDNS-é

Az mRNS enzimatikus átalakítása kétszálú insert DNS-é többféle eljárással is megvalósítható. Mindegyik a reverz transzkriptáz és a cDNS oligonukleotiddal előkészített szintézisét foglalja magában. Ezt követően az általánosan használt eljárások jelentősen eltérnek egymástól. Számos módszer létezik a második szál szintézisére és számos eljárás a klónozható DNS előállítására alkalmas végek előállítására. Ezen eljárások fő célja, hogy minél hosszabb inzert DNS-t állítsanak elő, amely az mRNS-nek a vektor DNS-hez ligálódni képes DNS-é való átalakításának nagy hozamával rendelkezik. Az alábbi protokollok csak kereskedelmi forgalomban kapható reagenseket igényelnek, és általában sikeresen állítanak elő jó cDNS-könyvtárakat. Az alapprotokoll egy olyan módszert ír le, amellyel tompa végű cDNS-t lehet előállítani, amelyet aztán linkerekhez lehet ligálni a későbbi klónozáshoz egy egyedi restrikciós helyre, például az EcoRI-hez. Az Alternatív protokoll egy olyan variáció, amely kevesebb enzimatikus manipulációt igényel, és lehetővé teszi az irányított cDNS-könyvtárak létrehozását, ami különösen akkor kívánatos, ha a cél expressziós cDNS-könyvtárak létrehozása. Az Alternatív protokoll kihasználja egy linker-primer előnyeit, amely (3′-tól 5′-ig sorrendben) egy oligo(dT) primerből, egy XhoI endonukleáz restrikciós helyből és egy (GA)20 ismétlésből áll, hogy megvédje a restrikciós helyet a tompított végű cDNS előállítása során. Az egyes cDNS-molekulák belső XhoI-helyeit 5-metil-dCTP beépítésével védjük az első szálú nukleotidkeverékbe. Az így kapott, egyedi végekkel rendelkező cDNS-ek klónozhatók EcoRI /XhoI -val emésztett vektorokba, miután az 5′ véghez EcoRI adaptorokat ligáltak, és XhoI-val emésztették a 3′ XhoI-helyeket, amelyeket a linker-primer épített be a cDNS-be. Ezek a változtatások egy jelentősen racionalizált eljárást eredményeznek, amely lényegesen gyorsabb és egyszerűbb, mint az alapprotokoll.