Bookshelf

Specimen Requirements and Procedure

Az ELISA-t polisztirollemezekben végzik, jellemzően 96 lyukú, a fehérjék nagyon erős megkötésére bevont lemezekben. Az ELISA típusától függően a vizsgálathoz elsődleges és/vagy másodlagos detektáló antitestre, analitre/antigénre, bevonó antitestre/antigénre, pufferre, mosásra és szubsztrátra/kromogénre van szükség. Az elsődleges detektáló antitest egy olyan specifikus antitest, amely csak az adott fehérjéhez kötődik, míg a másodlagos detektáló antitest egy második enzimkonjugált antitest, amely egy olyan elsődleges antitesthez kötődik, amely nem enzimkonjugált.

Az ELISA immunvizsgálat elvégzésének négy fő általános lépése van. Ezek a lépések a következők:

1. Bevonatolás (antigénnel vagy antitesttel)

2. Blokkolás (általában szarvasmarha-szérumalbumin hozzáadásával ).

3. Detektálás
4. végső leolvasás

   A detektálás egy olyan szubsztrát hozzáadásával történik, amely képes színt generálni. Az ELISA-detektáláshoz számos szubsztrát áll rendelkezésre. A leggyakrabban használt azonban a torma-peroxidáz (HRP) és az alkalikus foszfatáz (ALP). A HRP szubsztrátja hidrogén-peroxid, és kék színváltozást eredményez. Az ALP a nitrofenol sárga színét méri szobahőmérsékleten 15-30 perces inkubációs idő után, és általában P-nitrofenil-foszfátot (pNPP) használ szubsztrátként.

   A fenti négy lépés mindegyike között a lemez “mosása” történik pufferrel, például foszfát-pufferelt sóoldattal (PBS) és nem ionos detergenssel, a nem kötött anyag eltávolítására. Az egyes mosási lépések során a kutakat két vagy több alkalommal mossák, a követett speciális protokolltól függően.

   Az ELISA protokollban általában a koncentrációk sorozatos hígítását helyezik a lemez kutakba. Az eredmények mérése után a sorozatos hígítások adataiból egy standard görbét rajzolnak fel, amelynek x-tengelyén logaritmikus skála segítségével a koncentráció, y-tengelyén pedig lineáris skála segítségével az abszorbancia látható.

   Az ELISA-nak négy fő típusa van:

   • Direkt ELISA (antigénnel bevont lemez; antitest szűrése)

   • Indirekt ELISA (antigénnel bevont lemez; antigén/antitest szűrése)

   • Sandwich ELISA (antitesttel bevont lemez; szűrő antigén)
   • Kompetitív ELISA (szűrő antitest)

     Direkt ELISA

     A közvetlen és az indirekt ELISA is az ELISA-lemezek antigénnel való bevonásával kezdődik. Az első kötési lépés az antigén hozzáadása a lemezekhez, amelyeket egy órán át 37 °C-on inkubálnak, vagy 4 °C-on inkubálhatnak egy éjszakán át. Az inkubációs lépés befejezése után a következő lépés a lemezek kimosása a potenciálisan nem kötött antitestektől, és az ELISA lemezen lévő nem kötött helyek blokkolása olyan szerekkel, mint a BSA, ovalbumin, aprotinin vagy más állati fehérjék. Ez a második lépés azért fontos, mert megakadályozza a nem specifikus antitestek kötődését a lemezhez, és minimalizálja a hamis pozitív eredményeket. A puffer hozzáadása után a lemezt újra átmossuk, és egy kiválasztott enzimkonjugált primer detektáló antitestet adunk hozzá. A lemezt tovább inkubáljuk egy órán keresztül.

     A közvetlen ELISA során az elsődleges detektáló antitest közvetlenül a vizsgált fehérjéhez kötődik. Ezután a lemezt újra átmossuk, hogy eltávolítsuk a nem kötött antitestet, majd egy szubsztrátot/kromofort, például alkalikus foszfatázt (AP) vagy torma-peroxidázt (HRP) adunk a lemezhez, ami színváltozást eredményez. A minta színváltozását vagy a szubsztrát foszfátcsoportjainak AP általi hidrolízise, vagy a szubsztrátok HRP általi oxidációja okozza. A közvetlen ELISA alkalmazásának előnyei közé tartozik a másodlagos antitestek keresztreaktivitásának kiküszöbölése, és a kevesebb lépés miatt az indirekt ELISA-hoz képest gyors. Hátrányai közé tartozik a többi ELISA-típushoz képest alacsony érzékenysége és a reakció magas költsége.

     Indirekt ELISA

     Az indirekt ELISA lépései megegyeznek a direkt ELISA lépéseivel, kivéve egy további mosási lépést és a puffer eltávolítása után hozzáadott antitest típusokat. Az indirekt ELISA két antitestet igényel, egy elsődleges detektáló antitestet, amely az érdeklődésre számot tartó fehérjéhez tapad, és egy másodlagos, az elsődleges antitesthez komplementer enzimhez kötött antitestet. Először az elsődleges antitestet adjuk hozzá, majd egy mosási lépést követően az enzimhez konjugált másodlagos antitestet adjuk hozzá és inkubáljuk. Ezt követően a lépések ugyanazok, mint a közvetlen ELISA-nál, amely magában foglalja a mosási lépést, a szubsztrát hozzáadását és a színváltozás kimutatását.

     A közvetett ELISA a közvetlen ELISA-hoz képest nagyobb érzékenységgel rendelkezik. Emellett olcsóbb és rugalmasabb is, mivel sokféle primer antitestet lehet használni. Az egyetlen jelentős hátránya ennek az ELISA-típusnak a másodlagos detektáló antitestek közötti keresztreaktivitás kockázata.

     Sandwich ELISA

     A közvetlen és közvetett ELISA-tól eltérően a szendvics ELISA a lemez mélyedéseire felvitt befogadó antitesttel kezdődik. Azért nevezik “szendvicsnek”, mert az antigének két antitestréteg (befogadó és kimutató antitestek) közé vannak beékelve. Miután a befogadó antitestet a lemezekhez adtuk, a lemezeket lefedjük, és egy éjszakán át 4°C-on inkubáljuk. A bevonási lépés befejezése után a lemezeket PBS-szel mossuk, majd BSA-val puffereljük/blokkoljuk. A pufferes mosásokat legalább 1-2 órán keresztül végezzük szobahőmérsékleten. Végül a lemezt az antigén hozzáadása előtt még egyszer PBS-szel mossuk.

     Az érdeklődésre számot tartó antigént ezután a lemezekhez adjuk, hogy a befogadó antitesthez kötődjön, és 90 percig inkubáljuk 37 °C-on. A lemezt újra mossuk, majd az elsődleges detektáló antitestet adjuk a lemezhez, és további 1-2 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd puffer mosás következik. Ezután hozzáadjuk a másodlagos enzimkonjugált ellenanyagot, és további 1-2 órán át inkubáljuk. A lemezt újra átmossuk, és a színváltozást előidéző szubsztrátot adunk hozzá. A szendvics ELISA az összes ELISA-típus közül a legnagyobb érzékenységgel rendelkezik. Ennek az ELISA-típusnak a legnagyobb hátránya az idő és a költségek, valamint a szükséges “párosított pár” (kétértékű/multiértékű antigén) és másodlagos antitestek használata.

     Kompetitív ELISA

     A kompetitív ELISA a vizsgált szérumban lévő antigénre specifikus antitest jelenlétét vizsgálja. Ez az ELISA-típus két specifikus antitestet használ, egy enzimkonjugált antitestet és egy másik, a vizsgált szérumban jelen lévő antitestet (ha a szérum pozitív). A két antitestnek a lyukakba történő kombinálása lehetővé teszi az antigénhez való kötődésért való versengést. A színváltozás jelenléte azt jelenti, hogy a teszt negatív, mivel az enzimkonjugált antitest kötötte meg az antigéneket (nem pedig a tesztszérum antitestjeit). A színváltozás hiánya pozitív tesztet és a vizsgált szérumban lévő antitestek jelenlétét jelzi. A kompetitív ELISA alacsony specificitású, és hígított mintákban nem használható. Előnye azonban, hogy kevesebb mintatisztításra van szükség, egy adott mintában az antigének széles skáláját tudja mérni, kis antigének esetén is alkalmazható, és alacsony a variabilitása.