Eredmények és vita
A Jiang et al. által leírt “autofágikus fluxus” vizsgálat egy kvantitatív zöld fluoreszcens protein (GFP) riporter vizsgálat, amely a polyQ-GFP szabad GFP-hez való ratiometrikus változását méri Western blot elemzéssel. Egy multicisztronikus riporterkonstrukciót terveztünk, amely két fehérjét kódol; az N-terminális GFP-hez kapcsolódó poliQ-t és a szabad GFP-t. A vírus 2A (v2A) szekvenciát linker régióként helyezték el a két fehérjét kódoló szekvenciák között, hogy lehetővé tegyék a két különálló fehérje sztöchiometrikus transzlációját egy nyílt olvasási keretből (1a. ábra) .
A feltételezett Q52, Q31 és Q10-GFP konstrukciók előállítása a Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP multicisztronikus riporterkonstrukció felhasználásával. a A Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP konstrukció vektortérképe. b A CAA és CAG degenerált kodonhasználat összefoglalása ebben a konstrukcióban. c A konstrukció kromatográfiája, amely a véletlenszerűen egymás között elhelyezkedő glutaminkódoló CAG és CAA tripletteket ábrázolja. d A Q80-GFP-t tartalmazó konstrukció PCR-alapú kizárásos amplifikációjának sematikus ábrázolása a kisebb számú glutamin ismétlődést tartalmazó poliQ konstrukciók előállítása érdekében. e A Q80 szekvencia, amely mutatja a Q52, Q31 és Q10 primer kötőhelyeket. f A Q52, Q31 és Q10 konstrukciók létrehozására szánt primerek szekvenciái. g Analitikus agaróz gélelektroforézis a feltételezett Q80, Q52, Q31 és Q10 vektorok mindegyikére a polyQ régiót flankáló primerek használatával. A PCR-termék mérete ~ 270, ~ 180, ~ 120 és ~ 60 bp volt a tervezett feltételezett Q80, Q52, Q31 és Q10-GFP konstrukciók esetében
Egy 80 glutamin ismétlődést tartalmazó poliQ szekvenciát terveztünk (Q80). A szekvenciát úgy terveztük meg, hogy alacsony ismétlődési hasonlóságot biztosítsunk azáltal, hogy a glutamint kódoló CAG-tripleteket véletlenszerűen váltogattuk glutamint kódoló CAA-tripletekkel (1b, c ábra). A nukleotidcseréket szemmel végeztük, hogy félig véletlenszerű mintázatot hozzunk létre. Ez a nem ismétlődő szekvencia-tervezés nemcsak a szekvencia stabilitását növeli a baktériumokban való szaporodás során, hanem lehetővé tette olyan PCR-primerek tervezését is, amelyek a szekvencia specifikus régióihoz kapcsolódnak.
A fent leírt Q80-GFP-v2A-GFP konstrukciót kereskedelmi forgalomban szintetizáltuk (Biomatik Corporation) (lásd az 1. kiegészítő fájlt), és a BamHI és ClaI restrikciós helyeken keresztül szubklónoztuk a Kawakami laboratóriumban elérhető Tol2 transzpozon alapú, pT2AL200R150G géntranszfer vektorba (a továbbiakban: Tol2) (ábra). 1a és lásd a 2. kiegészítő fájlt).
A Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP konstrukció PCR-alapú kizárásos amplifikációjával hoztuk létre a kisebb számú glutamin ismétlődést tartalmazó PolyQ-konstrukciókat. A primereket úgy terveztük, hogy a glutamin ismétlődések meghatározott számát kizáró vektor körül amplifikáljanak a kívánt konstrukciók létrehozásához (1d-f ábra). Célunk az volt, hogy körülbelül 52 (Q52), 31 (Q31) és 10 (Q10) glutamin ismétlődéssel rendelkező vektorokat hozzunk létre. A feltételezett Q52 és Q31 vektorokat ugyanannak a reverz primernek a különböző forward primerekkel való párosításával hoztuk létre. Ez a közös reverz primer 2 glutamin ismétlődést amplifikált, míg a forward primerek a Q52 és Q31 vektorok létrehozásához szükséges további 50 és 29 glutamin ismétlődést amplifikálták. A reverz primer pozícióját kissé eltoltuk, hogy optimalizáljuk a feltételezett Q10 vektor amplifikációját, így a reverz primer most 5 glutamin ismétlődést amplifikált, míg a forward primer a fennmaradó 5 glutamin ismétlődést (1d-f ábra). A PCR-reakcióban szigorú lágyítási hőmérsékletet alkalmazva specifikus primer-kötést értünk el. A gélen kivont és tisztított PCR-termékeket foszforiláltuk, önligálással cirkularizáltuk, majd kompetens sejtekbe transzformáltuk (lásd a 3. kiegészítő fájlt). A poliQ régiót szegélyező primerekkel végzett PCR megközelítőleg a vélt Q52, Q31 és Q10 vektorok esetében várt termékméretet mutatott (1g. ábra). A létrehozott konstrukciókat szekvenáltuk annak megállapítására, hogy a várt polyQ ismétlődési számok jelen vannak-e. Míg a Q52 konstrukció a várt számú glutamin ismétlődéssel rendelkezett (2a., b. ábra), a szekvenálás kisebb eltéréseket mutatott a másik két konstrukció várt poliQ-számától, ahol a Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP vektor 21 glutamin ismétlődést tartalmazott (a továbbiakban: Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (2. ábra). 2c, d) és a Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP vektor 11-glutamin ismétlődéssel rendelkezett (a továbbiakban Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (2e. ábra, f). A további elemzés kimutatta, hogy a generált Q21 szekvencia közvetlenül az eredeti szekvenciából származik, és a glutamin ismétlődések elvesztése a Q31 forward primer 30 bp-mal a prediktált kötőhelytől lefelé történő kötődésének köszönhető. Ezzel szemben a Q11 szekvenciában lévő további glutamin ismétlődés de novo keletkezett, egy CAA kodon hozzáadása.
Vektortérkép és a Q52, Q21 és Q11-GFP-t kódoló, PCR-alapú kivágásos amplifikációval előállított konstrukciók szekvenciaelemzése. a Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP konstrukció vektortérképe. b A Q52 konstrukció kromatográfiája. c A Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP konstrukció vektortérképe. d A Q21 konstrukció kromatográfiája. e A Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP konstrukció vektortérképe. f A Q11 konstrukció kromatográfiája
A poliQ fehérje aggregációs kinetikájának és “autofágikus fluxusának” in vivo tanulmányozásához a létrehozott poliQ vektorokat (25 ng/μL) és transzpozáz mRNS-t (25 ng/μL) injektáltuk egysejtes zebrahal-embriócsoportokba (3a, b ábra). Minden csoportban anti-GFP ellenanyaggal Western blot analízist végeztünk 24 h poszt fertilizáció (hpf) utáni embrió lizátumokon (mintánként 10 embrió). Az üres Tol2 vektor (25 ng/μL) és a transzpozáz mRNS (25 ng/μL) injektált és nem injektált embriók kontrollként szerepeltek. A poliQ konstrukciókkal injektált embriók a várakozásoknak megfelelően két sávot mutattak ki az anti-GFP antitesttel; a poliQ-hoz kötött GFP-t (poliQ80-GFP ~ 48 kDa, poliQ52-GFP ~ 38 kDa, poliQ21-GFP ~ 33 kDa és poliQ11-GFP ~ 31 kDa) és a szabad GFP-t (~ 27 kDa) (3c. ábra). A poliQ-GFP-konstrukciót expresszáló embrió lizátumok mindegyike mutatott egy halványabb, nagyobb fehérjeméretű sávot is, amely a teljes hosszúságú poliQX-GFP-v2A-GFP konstrukciónak felel meg (poliQ80-GFP-v2A-GFP ~ 75 kDa, poliQ52-GFP-v2A-GFP ~ 65 kDa, poliQ21-GFP-v2A-GFP ~ 60 kDa és poliQ11-GFP-v2A-GFP ~ 58 kDa). Ez a sáv a teljes fehérje ~ 10%-át képviseli, amely a v2A szekvencia rendszer használata esetén egyetlen, teljes hosszúságú fehérjeként transzlálódik. A Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP és Q11-GFP:GFP arányok ~ 5, ~ 4, ~ 2 és ~ 1 (3d. ábra). Mivel a v2A szekvencia lehetővé teszi a polyQ-GFP és a GFP fehérjék sztöchiometrikus fordítását, elméletileg a polyQ-GFP:GFP aránynak 1-nek kellene lennie. A megfigyelt nagyobb arányok e fehérjék felhalmozódására utalhatnak. Ezek a megfigyelések összhangban vannak az irodalommal, ahol kimutatták, hogy a 19 glutaminmaradéknál több glutaminmaradékot tartalmazó poliQ-GFP fúziós konstrukciók hosszfüggő módon aggregálódnak a transzfektált sejtekben. Ezek a megfigyelések arra engednek következtetni, hogy a Tol2-QX-GFP-v2A-GFP konstrukcióink hasznos eszközt jelentenek az “autofágikus fluxus” in vivo tanulmányozására egy lárva zebrahal modellben.
A Tol2-QX-GFP-v2A-GFP konstrukció expressziójának elemzése D. rerio-ban. A zebrahal embriókba 25 ng/µL Tol2-QX-GFP-v2A-GFP konstrukciót és 25 ng/µL Tol2 transzpozitázt kódoló mRNS-t injektáltunk. a Fénymezős (felső panelek) és fluoreszcens (alsó panelek) képek a Q80, Q52, Q21 és Q11-GFP-t expresszáló zebrahal embrió fej és törzs régióinak bal oldali nézetéről, ~ 24 hpf. b Fénymezős (felső panelek) és fluoreszcens (alsó panelek) képek a Q80, Q52, Q21 és Q11-GFP-t expresszáló zebrahal embrió törzs és farok régióinak bal oldali nézetéről, ~ 24 hpf. c Western blot elemzés a Qx-GFP konstrukciók expressziójáról D. rerio-ban. A fehérjéket a Q80, Q52, Q21 és Q11-GFP konstrukciókat expresszáló ~ 24 hpf embriókból izoláltuk. A fehérjéket 10%-os SDS-PAGE gélen oldottuk fel és nitrocellulóz membránra vittük át. A membránt anti-GFP antitesttel szondáztuk. Az “üres” Tol2 vektor egy expresszált GFP génnel rendelkezik, amelyet a konstrukció beillesztése során kicseréltek. d Western blot mennyiségi meghatározás. A Western blot egyes számozott sávjainak GFP-intenzitása és a Qx-GFP és a szabad GFP aránya
Következtetés
Ez a tanulmány egy robusztus és könnyen alkalmazható megoldást kínál a poliQ ismétlődések tervezett hosszához közeli előállítására. A glutamin ismétlődések pontos számának előállítása érdekében további amplifikációs körök végezhetők módosított primer szekvenciákkal. Ezen túlmenően a primer hossza növelhető a templáthoz való kapcsolódás specifitásának fokozása érdekében. Technikánk számos előnnyel rendelkezik az ismétlődő régiók PCR-alapú amplifikációjának meglévő módszereivel szemben, és célja a nem specifikus PCR-termékek és hibás ismétlődések keletkezésének minimalizálása a genetikai kód kodon-redundanciájának kihasználásával, hogy szinonim DNS-kódoló szekvenciát hozzon létre csökkentett ismétlődéssel. Ezenkívül megközelítésünk nem korlátozódik a poliQ ismétlődő szekvenciák előállítására, hanem általánosítható más nukleotid ismétlődő szekvenciák előállítására is. Továbbá módszerünk viszonylag olcsó, mivel csak a kezdeti polyQ80-GFP-v2A-GFP konstrukcióhoz van szükség kereskedelmi szintézisre, amelynek költsége a nukleotidbázisonkénti ár, a hossz, a tisztaság és a tömeg függvénye. Az összes többi szükséges anyag a molekuláris klónozáshoz használt standard reagensek. Összefoglalva, a leírt technika könnyen alkalmazható, megfizethető megoldást kínál az ismétlődő kódolású DNS-szekvenciák előállítására, amelyek igény szerint manipulálhatók.