Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy

Signaling through the intrinsic pathway of apoptosis

In the mitochondrial pathway of apoptosis, a kaszpáz aktiváció szorosan kapcsolódik a külső mitokondriális membránnak a Bcl család proapoptotikus tagjai általi permeabilizációjához (Green és Kroemer, 2004). Számos citotoxikus inger és proapoptotikus jelátvivő molekula konvergál a mitokondriumokban, hogy a külső mitokondriális membrán permeabilizációját indukálja (Decaudin és mtsai., 1998; Green és Kroemer, 2004). Ezt a permeabilizációt a Bcl-2 családba tartozó fehérjék, a mitokondriális lipidek, a bioenergetikai metabolitfluxust szabályozó fehérjék és a permeabilitási átmeneti pórus komponensei szabályozzák (Green és Kroemer, 2004). A külső mitokondriális membrán megbontásakor egy sor olyan fehérje szabadul fel, amelyek általában a belső és a külső mitokondriális membránok közötti térben találhatók, köztük a citokróm c, a Smac/DIABLO, az Omi/HtrA2, az AIF és az endonukleáz G (Saelens és mtsai., 2004). A citoszolba kerülve ezek az apoptogén fehérjék a kaszpáz aktiváció elősegítésével vagy kaszpáz-független halál-effektorként működve kiváltják a sejthalált (Saelens et al., 2004).

A kaszpázfüggő apoptózis mitokondriális közvetítői

Citokróm c

A citokróm c felszabadulása a mitokondriumokból közvetlenül a citokróm c/Apaf-1/kaszpáz-9-tartalmú apoptoszóma komplex kialakulásán keresztül váltja ki a kaszpáz-3 aktivációt (Cain et al., 2000). A citoszolba kerülve a citokróm c az Apaf-1 C-terminális régiójához kötődik, amely egy olyan citoszolikus fehérje, amelynek N-terminális kaszpáz-rekriminációs doménje (CARD), a Caenorhabditis elegans CED-4-gyel homológiát mutató nukleotid-kötő doménje és 12-13 WD-40 ismétlődést tartalmazó C-terminális doménje van (Zou et al., 1997). A citokróm c kötődése az Apaf-1-hez megkönnyíti a dATP asszociációját az Apaf-1-hez és exponálja annak N-terminális CARD-ját, amely most oligomerizálódhat és platformmá válhat, amelyen az iniciátor kaszpáz-9 rekrutálódik és aktiválódik a CARD-CARD kölcsönhatáson keresztül (Adrain és mtsai., 1999). Ezt követően a végrehajtó kaszpáz-3 rekrutálódik az apoptoszómába, ahol a rezidens kaszpáz-9 aktiválja (Bratton és mtsai., 2001). A kaszpáz-3 ezután kulcsfontosságú szubsztrátokat hasít a sejtben, hogy az apoptózis számos celluláris és biokémiai eseményét előidézze.

Egyes esetekben a citoszolikus citokróm c által indított kaszpáz aktivitás hozzájárul a mátrix metalloproteináz (MMP) eséséhez, amint azt szintetikus kaszpáz inhibitorok és Apaf1 -/- sejtek alkalmazásával kimutatták (Waterhouse és mtsai., 2001). Ezenkívül a kaszpáz aktivitás tovább károsítja a permeabilizált mitokondriumok működését azáltal, hogy befolyásolja az I. és II. komplexek aktivitását, ami elkerülhetetlenül az MMP csökkenéséhez és reaktív oxigénfajok keletkezéséhez vezet (Ricci és mtsai., 2004). Így a citoszolikus változásokból eredő másodlagos események, amelyeket a citokróm c és más mitokondriális IMS-fehérjék felszabadulása okoz, visszahatnak a permeabilizált mitokondriumokra, és befolyásolhatják azok működését. Fontos, hogy a kaszpáz aktivitásnak ez a mitokondriális erősítő hurokja kritikusan meghatározhatja a rákos sejteknek a citotoxikus kezelésekre adott válaszát.

Mellett a közelmúltban bizonyíték van a kaszpáz aktiváció citokróm c-től és apoptoszómától független, de Apaf-1-függő mechanizmus(ok) létezésére. A citokróm c egy olyan variánsának célzott kopogtatása, amely nem rendelkezik apoptogén tulajdonságokkal, de elektronátvivő és antioxidáns aktivitással (K72A), lehetővé tette a citokróm c apoptózishoz való hozzájárulásának értékelését anélkül, hogy az oxidatív foszforilációban betöltött funkcióját befolyásolta volna (Hao és mtsai., 2005). Érdekes módon a KA/KA egerekből származó timociták jelentősen érzékenyebbek voltak a halálozási ingerekre, beleértve az etopozidot és a γ-sugárzást, mint az Apaf-1(-/-) timociták (Hao és mtsai., 2005). γ-sugárzással történő kezelés hatására a prokaszpázok hatékonyan aktiválódtak az apoptotikus KA/KA timocitákban, de Apaf-1 oligomerizáció nem volt megfigyelhető (Hao et al., 2005), ami a citokróm c és az Apaf-1 eltérő követelményére utal az apoptózisban.

Smac/DIABLO

A mitokondriumokból felszabaduló egyéb fehérjék, mint a Smac/DIABLO és az Omi/HtrA2, a kaszpázok endogén inhibitorainak, az apoptózis inhibitor fehérjéknek (IAP) a semlegesítése révén elősegítik a kaszpázok aktiválódását. A Smac és egér homológja, a DIABLO nukleárisan kódolt mitokondriális fehérjék, amelyek tartalmaznak egy mitokondriális lokalizációs jelet, amelyet a mitokondriális import során proteolitikusan eltávolítanak, hogy az érett 23 kDa fehérje keletkezzen (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000). Ez az érési lépés exponálja az IAP-kötő motívumot (IBM) a Smac/DIABLO N-terminusán (Du et al., 2000) (1. táblázat). A második mitokondriumból származó kaszpáz aktivátor/DIABLO-ról kimutatták, hogy BIR-függő módon kötődik a XIAP-hoz, cIAP1-hez, cIAP2-hez, survivinhez és Apollonhoz (Vaux és Silke, 2003) (2. ábra),és homodimerként viselkedik, ahol az IBM kétértékű konfigurációban van jelen (Chai és mtsai., 2000). Egy Smac/DIABLO dimer egy XIAP molekulát köt meg mindkét IAP-kötő motívummal, az egyik a BIR2-vel, a másik a BIR3-mal lép kölcsönhatásba (Huang és mtsai., 2003). Érdekes módon ugyanez a BIR3 barázda köti meg a kaszpáz-9 kis alegységének N-terminálisán exponált IBM-et (Ala-Thr-Pro-Phe) az Asp315 utáni autokatalitikus feldolgozást követően, lehetővé téve a Smac/DIABLO számára, hogy kiszorítsa a kaszpáz-9-et az XIAP-ból (Srinivasula et al., 2001) (1. táblázat).

A Smac/DIABLO élettani mitokondriális funkciója ismeretlen, a DIABLO -/- egerek normálisnak tűnnek (Okada és mtsai., 2002). Bár a procaszpáz-3 in vitro hasadása citokróm c hozzáadására gátolt volt a Smac -/- sejtek lizátumaiban, a Smac -/- egerek és sejtek normálisan reagáltak az olyan apoptotikus ingerekre, mint az UV-sugárzás, staurosporin, etopozid és TNF/ciklohexamid (Okada és mtsai., 2002). Ezek a megfigyelések redundáns faktorok létezésére utalnak, amelyek kompenzálják a Smac/DIABLO elvesztését, valószínűleg a HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 egy nukleárisan kódolt, 49 kDa fehérje, amelynek N-terminális mitokondriális lokalizációs jele közvetíti a mitokondriális intermembrán térbe történő transzlokációját (Suzuki et al., 2001; Martins és mtsai., 2002; van Loo és mtsai., 2002). Az Omi/HtrA2 az intermembrán térben processzálódik a 37 kDa-os érett formává, felszabadítva egy IBM-et az N-terminusán (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (1. táblázat). Bár a rekombináns Omi/HtrA2 képes katalizálni saját érését in vitro, a sejtekben történő éréséért felelős proteáz továbbra sem ismert (Martins és mtsai., 2002). Az Omi/HtrA2 alapvető szerepet játszik a mitokondriális homeosztázis szabályozásában, amihez proteolitikus aktivitására van szükség, bár az Omi/HtrA2 molekuláris célpontjai és interakciós partnerei a mitokondriumban még nem kerültek meghatározásra (Saelens és mtsai., 2004). Miután az Omi/HtrA2 a mitokondriumból a citoszolba kerül, az IAP-ok antagonizálásával kaszpáz-függő módon, illetve proteázként kaszpáz-független módon elősegíti a sejthalált (Saelens és mtsai., 2004). A Smac/DIABLO-hoz hasonlóan az Omi/HtrA2 is blokkolja az IAP-okat az N-terminális IAP-kötő motívumán keresztül, amely trimerikus konfigurációban jelenik meg (Li et al., 2002)

Noha a citokróm c citoszolba történő felszabadulása közvetlenül kiváltja a kaszpáz-3 aktiválódását a citokróm c/Apaf-1/kaszpáz-9 tartalmú apoptoszóma komplex kialakulásán keresztül, a Smac/DIABLO és az Omi/HtrA2 közvetve elősegíti a kaszpáz aktiválódását az IAP-okra gyakorolt gátló hatások antagonizálásán keresztül (Saelens és mtsai., 2004). Így a pro- és antiapoptotikus effektormolekulák között dinamikus egyensúly áll fenn, ami lehetővé teszi, hogy a sejt korlátozott mitokondriális károsodással is megbirkózzon, ebben az esetben az IAP-ok megfelelően képesek blokkolni a kis mennyiségű felszabaduló citokróm c által kezdeményezett kaszpáz aktivációt. Olyan körülmények között azonban, amikor a mitokondriális károsodás folytatódik vagy egyidejűleg több mitokondriumot érint, az IAP-ok által támasztott antiapoptotikus akadályt az antagonistáik, a Smac/DIABLO és a HtrA2/OMI magasabb citoszolikus koncentrációjával lehet legyőzni, amelyek közvetlen kötődéssel semlegesítik az IAP-okat.

Egyre több bizonyíték van arra, hogy a rákos sejtek rendelkeznek egy intrinsic apoptózishajlammal, amelyet az IAP-ok tartanak kordában. Ennek érdekében a kaszpáz-3 és kaszpáz-8 aktivitás magas bazális szintjét és aktív kaszpáz-3 fragmentumokat mutattak ki apoptózis hiányában különböző tumoros sejtvonalakban és rákos szövetekben, de normális sejtekben nem (Yang és mtsai., 2003a). A tumorsejtek, de a normál sejtek nem expresszáltak nagy mennyiségű IAP-ot is, ami arra utal, hogy a felszabályozott IAP-expresszió szelektíven ellensúlyozta a magas bazális kaszpáz-aktivitást a tumorsejtekben (Yang és mtsai., 2003a). Ezért az IAP-okat célzó stratégiák ígéretes megközelítésnek tekinthetők a citotoxikus terápiák hatékonyságának szelektív fokozására a rákos sejtekben. Ebből a célból a Smac/DIABLO transzfekcióval kényszerített expressziója csökkentette a TRAIL által kiváltott ölés küszöbértékét különböző tumorokban (Ng és Bonavida, 2002; Okano és mtsai., 2003), valamint érzékenyítette a rákos sejteket a kemoterápiára (McNeish és mtsai., 2003; Zhao és mtsai., 2006). Úgy tűnik azonban, hogy az endogén Smac/DIABLO transzlokációja a citoszolba a rákellenes gyógyszerek által kiváltott apoptózis során bizonyos körülmények között nem játszik jelentős szerepet, például humán tüdőkarcinóma sejtekben etopozid kezelés hatására (Bartling és mtsai., 2004). A Smac/DIABLO kis interferáló RNS-sel (siRNS) történő downregulációja nem befolyásolta az etopozid általi pusztulást ezekben a sejtekben, bár egy IAP-kötő peptid, a Smac-N7 fokozta az etopozid által kiváltott apoptózist (Bartling és mtsai., 2004). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a Smac/DIABLO hiányát redundáns determinánsok hatása kompenzálhatja bizonyos rákos sejtekben.

A kaszpáz-független apoptózis mitokondriális közvetítői

A mitokondriális intermembrán térből való felszabadulása után a HtrA2/OMI a kaszpáz-független módon is hozzájárul a sejthalálhoz mint proteáz amellett, hogy kaszpáz-függő módon az IAP-ok antagonizálásával elősegíti az apoptózist (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). In vitro adatok bizonyították a XIAP, cIAP1, cIAP2 és Apollon lebontását a HtrA2/OMI proteáz aktivitása által (Suzuki és mtsai., 2004). Emellett Trencia és munkatársai (2004) kimutatták az antiapoptotikus PED/PEA-15 kölcsönhatását a citoszolikus HtrA2/OMI-val és annak lebontását. A HtrA2/OMI szintjének csökkentése a sejtekben antisense vagy RNS interferenciával csökkenti a különböző rákos sejtvonalak érzékenységét a staurosporin, Fas, UV vagy ciszplatin által kiváltott sejthalállal szemben (Martins et al., 2002).

Az AIF és az endonukleáz G továbbá a külső mitokondriális membrán permeabilizációjakor felszabadul a mitokondriumokból, és transzlokálódik a sejtmagba, hogy hozzájáruljon a nukleáris kromatin kondenzációjához és a nagymértékű DNS-fragmentációhoz (Cande és mtsai., 2004; Saelens és mtsai., 2004). Azt, hogy ez a két fehérje a citokróm c előtt, együtt vagy utána szabadul-e fel, ellentmondásos viták tárgyalták (Arnoult és mtsai., 2002). Az sem tisztázott még pontosan, hogy az AIF hogyan járul hozzá a nukleáris DNS-fragmentációhoz, mivel nem rendelkezik intrinsic DNáz-aktivitással. Emlős sejtekben a ciklofilin A, egy peptidil-prolil cisz-transz izomeráz együttműködik az AIF-fel a DNS lebontásának indukálásában (Cande és mtsai., 2004).

A belső útvonal megszakadása a rákban

A mitokondriális útvonal szabályozásában részt vevő gének mutációi nagyon gyakoriak a rákos sejtekben. Mivel a rákellenes terápiák többsége az intrinzikus útvonal beindításával apoptózist indukál a rákos sejtekben, az ilyen mutációk általában a kezeléssel szembeni rezisztenciával járnak együtt. Például a Bcl-2 túlexpressziója, amely a bcl-2 onkogénnek az immunglobulin nehézlánc génlokuszba történő kromoszómális transzlokációjának eredménye, a humán follikuláris limfómák mintegy 85%-ához társul (Tsujimoto és mtsai., 1984). Transzgenikus egerekkel végzett kísérletek kimutatták, hogy a Bcl-2 overexpressziója elősegítheti a B- és T-limfociták és myeloid sejtek neoplasztikus transzformációját (McDonnell és Korsmeyer, 1991; Traver és mtsai., 1998).

Azt a tényt figyelembe véve, hogy az antiapoptotikus Bcl-2 család tagjainak overexpressziója elősegíti az onkogenezist, ebből következik, hogy e család több BH doménes proapoptotikus tagjai tumorszuppresszorként működnek. Mivel azonban a Bax és a Bak szerepe az apoptózisban nagymértékben átfedésben van, nehéz volt megállapítani, hogy ez a hipotézis igaz-e, és valóban, a bax-/- egerek nem hajlamosak jelentősen a neopláziára (Knudson és mtsai., 2001). Ugyanakkor a bax gént inaktiváló szomatikus mutációkat találtak bizonyos szolid tumorokban és hematológiai malignitásokban. Erre vonatkozóan leírtak olyan egynukleotid szubsztitúciós vagy frameshift mutációkat, amelyek inaktiválják a Bax gént a mismatch repair-deficient (MMR) vastagbélrákban vagy hematopoetikus malignitásokban (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).

Mellett egyre több bizonyíték van arra, hogy a BH3-only fehérjék hozzájárulhatnak a malignus transzformáció elnyomásához, ami arra utal, hogy jóhiszemű tumorszupresszorként működhetnek. Például kimutatták, hogy a Bim egyetlen alléljának elvesztése felgyorsítja a c-myc transzgén expressziója által indukált B-sejtes limfomagenezist (Egle és mtsai., 2004), összhangban a Bimnek a limfoid homeosztázis szabályozójaként betöltött kulcsszerepével (Strasser, 2005). Érdekes módon a közelmúltban homozigóta deléciókat azonosítottak a bim gént rejtő kromoszómarégióban köpenysejtes limfómában szenvedő betegeknél (Tagawa és mtsai., 2005). A bid gén hiányát mutató egerekben spontán myeloproliferatív rendellenesség alakul ki, amely a krónikus myelomonocytás leukémiához (CMML) hasonló malignitásig fejlődhet (Zinkel és mtsai., 2003). Továbbá a Puma RNSi-mediált szuppressziója a Myc-indukált lymphomagenezist gyorsítja (Hemann és mtsai., 2004).

A genetikai változásokon kívül a Bcl-2 család fehérjéinek aberráns expresszióját többnyire transzkripciós vagy poszt-transzkripciós szinten szabályozzák. Például számos antiapoptotikus Bcl-2 családba tartozó fehérje, például a Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 vagy Bfl-1 expresszióját az NF-κB transzkripcionálisan szabályozza (Cory és Adams, 2002).

A Bcl-2 családba tartozó fehérjék mellett az Apaf-1 csökkent vagy hiányzó aktivitását találták petefészekrákban, melanomában és leukémiában. Továbbá a p53 tumorszupresszor gén mutációi, a humán rákok leggyakoribb genetikai hibája, befolyásolják az intrinzikus útvonalat. A p53 aktivációja például számos olyan gént szabályoz felfelé, amelyek promóterében p53-reagáló elemek vannak jelen, mint például a proapoptotikus BH3-only fehérjék, a Puma, a Noxa és a Bid (Oda és mtsai., 2000; Yu és mtsai., 2001; Sax és mtsai., 2002). Ennek eredményeként azok a sejtek, amelyekben a p53 stabilizálódik, érzékenyek a mitokondriális sejthalál útjának aktiválására. Ezenkívül a p53 közvetlenül befolyásolhatja a mitokondriumok integritását anélkül, hogy génaktiválásra lenne szükség. Valóban, arról számoltak be, hogy a p53 képes kötődni a Bcl-2 és Bcl-XL sejtekhez a mitokondriumokban, ezáltal elősegítve a mitokondriális destabilizációt (Mihara et al., 2003).

A belső útvonalon keresztüli jelátvitel a rákterápiában

A legtöbb hagyományos kemoterápiás szer, például az etopozid, a doxorubicin, a ciszplatin vagy a paclitaxel közvetett módon, a köztes anyagcsere zavarainak kiváltásával vagy a proapoptotikus másodlagos hírvivők koncentrációjának növelésével váltja ki a mitokondriumok permeabilizációját, például a p53 expressziójának indukálásával, a ceramid/GD3 útvonal indukálásával, a CD95/CD95L ligandumrendszer indukálásával, a Bcl-2-féle fehérjék befolyásolásával és/vagy a redox- vagy energiaegyensúly veszélyeztetésével.

Egyre több bizonyíték van a DNS-károsodást követő nukleo-mitokondriális keresztbeszélgetés létezésére. Például a DNS-károsodásból eredő apoptotikus jelek a tumorszuppresszor p53-on keresztül továbbíthatók a mitokondriumokba, amelyek viszont apoptogén faktorokat szabadítanak fel a citoplazmába, amelyek aktiválják a downstream pusztító programokat (Moll és mtsai., 2005). A p53 közvetve a mitokondriális útvonalat a proapoptotikus Bcl-2 fehérjék, például a Bid, Puma vagy Noxa expressziójának transzkripciós aktiválásával kapcsolhatja be (Oda és mtsai., 2000; Yu és mtsai., 2001; Sax és mtsai., 2002). Emellett a p53 transzkripciótól független módon közvetlenül is kiválthatja a külső mitokondriális membrán permeabilizációját a Bax vagy Bak proapoptotikus Bcl-2 fehérjék közvetlen aktiválásával vagy az antiapoptotikus Bcl-2 fehérjék, például a Bcl-2 vagy a Bcl-XL kötésével és inaktiválásával (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Fontos, hogy a mitokondriálisan célzott p53-ról nemrégiben kimutatták, hogy in vivo is tumorszuppresszor aktivitással rendelkezik (Talos és mtsai., 2005).

Mellett a kaszpáz-2 rendelkezik azzal a képességgel, hogy DNS-károsodásra válaszul a külső mitokondriális membrán permeabilizálásával és/vagy a citokróm c belső mitokondriális membránhoz való társulásának megbontásával bekapcsolja a mitokondriális apoptotikus útvonalat. Ezért a procaszpáz-2 antisense-szel stabilan transzfektált vagy siRNS-t tranziens módon expresszáló sejtek refrakterek voltak a citokróm c felszabadulására és a DNS-károsodás által indukált különböző downstream eseményekre, mint például a kaszpáz aktiváció és a DNS-fragmentáció (Lassus és mtsai., 2002; Robertson és mtsai., 2002). A kaszpáz-2 közvetett módon is hathat a mitokondriumokra, például a Bid proapoptotikus fehérje hasításával, majd annak a mitokondriumba történő transzlokációjával a citokróm c felszabadulását indukálja (Guo és mtsai., 2002). Ezenkívül a kaszpáz-2 közvetlenül permeabilizálhatja a külső mitokondrium membránját és stimulálhatja a citokróm c és a Smac/DIABLO felszabadulását, valószínűleg a feldolgozott kaszpáz-2 közvetlen kölcsönhatásának eredményeként a külső mitokondriális membránban található feltételezett fehérjékkel és/vagy foszfolipidekkel, vagy a külső és belső membránok közötti érintkezési helyeken (Robertson és mtsai., 2004). A külső mitokondrium membránjának permeabilizációja a kaszpáz-2 zimogén feldolgozását igényli, de nem a hozzá kapcsolódó proteolitikus aktivitást, és a Bcl-2 család számos fehérjétől, köztük a Bax, Bak és Bcl-2 fehérjéktől függetlenül történik (Robertson és mtsai., 2004). Kimutatták továbbá, hogy a kaszpáz-2 meglepő módon képes megbontani a citokróm c és az anionos foszfolipidek, nevezetesen a kardiolipin közötti társulást, ezáltal további citokróm c-t tesz elérhetővé a citoszolba történő felszabaduláshoz (Enoksson és mtsai., 2004). A DNS-károsodás hatására a kaszpáz-2 aktiválódik az úgynevezett PIDDoszómában, amely a p53-indukálható, halál-domént tartalmazó PIDD fehérje, a kaszpáz-2 és az adaptor fehérje RAIDD komplexe (Tinel és Tschopp, 2004), ami egy nukleo-mitokondriális apoptotikus útvonal létezésére utal.

Azt is jelentették, hogy a hiszton H1.2 fontos szerepet játszik az apoptotikus jelek továbbításában a sejtmagból a mitokondriumba a DNS kettősszál-töréseket követően (Konishi et al., 2003). A nukleáris hiszton H1.2 egy p53-függő mechanizmuson keresztül szabadul fel a citoplazmába a DNS kettősszál-törések után, és Bak-függő módon indukálja a citokróm c felszabadulását az izolált mitokondriumokból (Konishi és mtsai., 2003). A H1.2 expressziójának csökkentése fokozta a sejtek ellenállását a röntgensugárzás vagy etopozid által indukált apoptózissal szemben (Konishi és mtsai., 2003).

Még a közelmúltban a Nur77 (más néven TR3) árva nukleáris receptort a mitokondriumokban a Bcl-2 apoptotikus gépezethez kapcsolták (Lin és mtsai., 2004). A Nur77 kötődése a Bcl-2 N-terminális hurok régiójához, amely a BH4 és BH3 domének között található, olyan Bcl-2 konformációs változást indukál, amely exponálja a BH3 domént, ami a Bcl-2 védőből gyilkossá való átalakulását eredményezi (Lin et al., 2004). Érdekes módon a Nur77-család egyik tagjának emelkedett szintjét a kemoterápiás szerekre adott kedvező válaszokkal hozták összefüggésbe a betegeknél (Shipp és mtsai., 2002).

Ezeken túlmenően a sejtek stressz hatására, beleértve a kemoterápiás szereket is, specifikus proapoptotikus Bcl-2 családtagok aktiválódnak, derepresszálódnak vagy indukálódnak, és ezáltal szenzorként működnek. A BH3-only fehérjék aktivitását több mechanizmus tartja kordában, ami normális körülmények között távol tartja ezeket a fehérjéket a multidomain Bcl-2 társaiktól, ugyanakkor lehetővé teszi gyors aktiválásukat stressz körülmények között (Bouillet és Strasser, 2002). Mint már említettük, a Bcl-2 családba tartozó fehérjék, mint például a Bid, a Puma vagy a Noxa a tumorszuppresszor p53 transzkripciós kontrollja alatt állnak, és ezért DNS-károsító ágensek hatására felszabályozódnak (Oda és mtsai., 2000; Yu és mtsai., 2001; Sax és mtsai., 2002). A csak BH3-at tartalmazó Bim fehérje, amely a mikrotubulusokhoz kötődve a citoszkeletonhoz kapcsolódik, a mikrotubulusok összeszerelésére ható taxollal való kezelést követően felszabadul és aktiválja az intrinzikus útvonalat (Sunters és mtsai., 2003). Nemrégiben kimutatták, hogy a paclitaxel in vitro és in vivo is indukálja a Bim felhalmozódását és a Bim-függő apoptózist epithelialis tumorokban (Tan és mtsai., 2005). Az aktív BH3-only fehérjék megkötik és ellensúlyozzák az antiapoptotikus és bizonyos esetekben aktiválják a multidomain proapoptotikus Bcl-2 család tagjait, ami a mitokondriális membrán permeabilitásának elvesztéséhez vezet (Bouillet és Strasser, 2002). Az, hogy a Bcl-2 fehérjék hogyan idézik elő a mitokondriális külső membrán zavarát, még vita tárgyát képezi, és magában foglalhatja a Bcl-2 család egyes fehérjéinek pórusképző és önoligomerizáló képességét, a mitokondriális permeabilitási átmeneti pórus Bcl-2 család fehérjék általi modulációját és/vagy a mitokondriális membránokon belüli lipidváltozásokat és lipidfehérje kölcsönhatásokat. Ezenkívül a kemoterápiás szerek, mint például a paclitaxel, a Bcl-2 hiperfoszforilációját és inaktiválását okozzák, és ezzel egyidejűleg kedveznek a permeabilitási átmeneti (PT) pórus megnyílásának (Ruvolo et al, 2001).

A kemoterápiás szerek a külső mitokondriális membrán permeabilitását a sejtek redoxpotenciáljának változásai révén is előidézhetik vagy elősegíthetik, a reaktív oxigénfajok fokozott keletkezése (vagy méregtelenítésük csökkenése), a redukált glutation kimerülése vagy a NADPH kimerülése miatt, mivel a mitokondriális megacsatorna számos redoxérzékeny hellyel rendelkezik (Debatin és mtsai., 2002). Ezenkívül az energiaanyagcserében bekövetkező változások, például az ADP és az ATP kimerülése elősegítheti a permeabilitási átmeneti pórus komplex (PTPC) megnyitását, mivel az ADP és az ATP az adeninnukleotid-transzlokátor fiziológiás ligandumai, amelyek a PTPC endogén inhibitoraként működnek (Costantini és mtsai., 2000). Emellett a légzési lánc lekapcsolása vagy gátlása, illetve a mátrix lúgosítása is kedvezhet a mitokondriális membrán permeabilizációjának. Ezenkívül a mitokondriális membránpermeabilizációhoz hozzájárulhatnak a lipid hírvivők, például a ceramid, amely számos apoptózist kiváltó stimulusnak, köztük citotoxikus gyógyszereknek kitett sejtekben keletkezik (Susin és mtsai., 1997). Magas koncentrációban. egyes kemoterápiás gyógyszerek, például az etopozid vagy a paclitaxel, izolált mitokondriumokban a mitokondriumok külső membránjának permeabilizációját is kiválthatják (Robertson és mtsai., 2000; Kidd és mtsai, 2002).

Ezeken kívül egyre több kísérleti rákellenes gyógyszer, köztük az arzenit, a lonidamid, a szintetikus retinoid CD437 vagy a természetes termék betulinsav, bizonyítottan közvetlenül hat a mitokondriumokra (Debatin és mtsai., 2002). Például arról számoltak be, hogy a betulinsav apoptózist vált ki azáltal, hogy izolált mitokondriumokban közvetlenül kiváltja a mitokondriális membránpotenciál elvesztését olyan módon, amelyet a Z-VAD-fmk kaszpázgátló nem befolyásol, ugyanakkor a BA, a PTPC inhibitora, vagy a Bcl-2 és Bcl-XL gátolja (Fulda et al., 1998b).

Az intrinzikus útvonalat célzó stratégiák

Bcl-2 család fehérjéi

Mivel az antiapoptotikus Bcl-2 fehérjék, amelyek hatásosan blokkolják az intrinzikus apoptózis útját, emelkedett szinten találhatók mind a hematológiai, mind a nem hematológiai eredetű emberi rákokban (Cotter, 2004), ígéretes célpontot jelentenek a terápiás beavatkozások számára. Következésképpen számos stratégiát fejlesztettek ki a Bcl-2 fehérjék megcélzására, például antisense technikákat, BH3-domén peptideket vagy szintetikus kis molekulájú gyógyszereket, amelyek beavatkoznak a Bcl-2-féle fehérjék működésébe. A Bcl-2 expresszió leszabályozására a Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, USA) Bcl-2 antisense oligonukleotideket (genasense) fejlesztett ki. A genasense egy szintetikus, 18 bázisú, egyszálú foszforotioát oligonukleotid, amely szelektíven a Bcl-2 fehérjét kódoló mRNS nyílt olvasási keretének első hat kodonját (azaz 18 bázist) célozza meg (Cotter, 2004). A genasense-kezelés jelentősen fokozta számos kemoterápiás gyógyszer, például taxánok, antraciklinek, alkilátorok vagy platina-tartalmú szerek tumorellenes hatását (Cotter, 2004). A melanoma preklinikai modelljében a genasense előkezelés növelte a humán melanoma kemoszenzitivitását (Jansen és mtsai., 1998). Egy klinikai vizsgálatban szintén arról számoltak be, hogy a genasense kemoszenzitizátorként hatott a dakarbazinra rosszindulatú melanomás betegeknél (Jansen és mtsai., 2000). Az antisense-alapú terápia optimalizálására később olyan bispecifikus antisense oligonukleotidokat terveztek, amelyek egy olyan szekvencia ellen irányultak, amely a Bcl-2 és a Bcl-xL mRNS-ben nagymértékben homológ, de a Bcl-xS mRNS-ből hiányzik (Zangemeister-Wittke és mtsai., 2000). A Bcl-2 és a Bcl-xL egyidejű downregulációja apoptózist és fokozott kemoszenzitivitást indukált különböző rákos sejtekben (Gautschi és mtsai., 2001; Tortora és mtsai., 2003; Milella és mtsai., 2004; Yamanaka és mtsai., 2005).

A továbbiakban BH3 domén peptideket vagy szintetikus kis molekulájú inhibitorokat fejlesztettek ki az anti-apoptotikus Bcl-2 hasonló fehérjék célpontjaira. A BH3-domén egy kilenc aminosavból álló amfipatikus α-hélixből áll, amely a Bcl-2-féle fehérjék hidrofób zsebéhez kötődik (Cory és Adams, 2002). Hasonlóképpen, a BH3-domén peptidek célja ennek a komplexnek a megbontása, ezáltal a rákos sejtek érzékenyítése az apoptózisra (Letai és mtsai., 2002). Emellett a Bid BH3-domén nem természetes aminosavakkal történő helyettesítése a kölcsönható régióval ellentétes felületen szénhidrogén kapcsolgatással stabilizált BH3 peptideket eredményezett, amelyeket SAHB-nak (stabilized α-helix of Bcl-2 domains) neveztek el, és amelyek jobb farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek (Walensky és mtsai., 2004). Ezek a stabilizált BH3 peptidek különböző leukémiás sejtvonalakban apoptózist váltottak ki, és egerekben káros mellékhatások nélkül gátolták a leukémiás xenotranszplantátumok növekedését is (Walensky és mtsai., 2004).

Emellett számos olyan kismolekulás vegyületet azonosítottak, amelyek beavatkoznak a Bcl-2/Bcl-xL funkcióba. A Bcl-2 fehérjék BH3 zsebéhez kötődni képes vegyületek kémiai könyvtárának szűrése a HA14-1, egy olyan vegyület azonosítását eredményezte, amely a Bakkal versenyez a Bcl-2 kötődéséért (Wang és mtsai., 2000). Degterev és munkatársai (2003) 16 320 előválogatott vegyületből álló könyvtárat szűrve arra vonatkozóan, hogy fluoreszcens polarizációs tesztben képesek-e kiszorítani egy fluoreszcens Bak BH3 peptidet a Bcl-xL-ből, a BH3 inhibitoroknak (BH3I) nevezett szerek két osztályát azonosították, amelyek intakt sejtekben is megbontják a Bcl-xL Bax-szal és Bad-dal alkotott komplexét.

Magmágneses rezonancia (NMR) alapú szűrést, párhuzamos szintézist és szerkezetalapú tervezést alkalmazva nemrégiben felfedezték a Bcl-2, Bcl-X(L) és Bcl-w antiapoptotikus fehérjék kismolekulás inhibitorát, az ABT-737-et. Az ABT-737 hatásos volt egyes limfómák és szolid tumorok ellen, és szinergista citotoxicitást mutatott kemoterápiákkal és sugárkezeléssel (Oltersdorf és mtsai., 2005).

Smac/DIABLO agonisták

A XIAP ellen irányuló potenciálisan terápiás kismolekulák tervezéséhez a legtöbb figyelmet a XIAP BIR3 doménjének kötőbarázdája vonzotta, amelyhez a Smac/DIABLO a mitokondriumból való felszabadulása után kötődik. A szerkezeti elemzés egyértelmű indoklást adott olyan kis vegyületek szintéziséhez, amelyek képesek utánozni a Smac/DIABLO kaszpáz-9 kiszorító aktivitását a XIAP BIR3-ból (Chai és mtsai., 2000; Wu és mtsai., 2000). Az intracelluláris szállítás fokozása érdekében a Smac peptideket hordozóhoz kapcsolták, például a HIV Tat fehérje fehérjetranszdukciós motívumához (Fulda és mtsai., 2002), a Drosophila antennapaedia penetratin szekvenciájához (Arnt és mtsai., 2002) vagy egy poliarginin szakaszhoz (Yang és mtsai., 2003b). Az érett Smac/DIABLO N-terminusát képviselő heptapeptidről, amely nélkülözhetetlen a XIAP-hoz való kötődéshez, azt jelentették, hogy elősegíti a kaszpáz aktivációt és érzékenyíti a különböző tumorsejtvonalakat, valamint a primer betegekből származó tumorsejteket a halálreceptor-ligáció vagy citotoxikus gyógyszerek által kiváltott apoptózisra (Fulda és mtsai., 2002). Fontos, hogy a Smac peptidek még in vivo is fokozták a TRAIL tumorellenes aktivitását egy intrakraniális malignus glioma xenograft modellben (Fulda és mtsai., 2002b). Hasonlóképpen, egy 8-mer peptid (AVPIAQKS), amely a Drosophila antennapaedia penetratin fehérjetranszdukciós doménjéhez fuzionált, képes volt bejutni az emlőrákos sejtekbe, kötni a XIAP-ot és a cIAP1-et, és erősíteni a kaszpáz aktivitást, amelyet számos rákellenes gyógyszer, köztük a paclitaxel, etopozid, 7-etil-10-hidroxikamptotekin (SN-38) és doxorubicin indukált (Arnt et al., 2002). Sőt, a Smac/DIABLO háromdimenziós szerkezete alapján a XIAP BIR3 komplexben Smac peptidomimetikumokat terveztek, amelyek a TRAIL-lal, TNFα-val, ciszplatinnal vagy etopoziddal együttműködve apoptózist váltottak ki a tumorsejtekben (Li és mtsai., 2004; Sun és mtsai., 2004a, 2004b, 2005).

Következtetésképpen a XIAP nem-peptidikus kismolekulás antagonistáit, amelyeket fágkönyvtár vagy polifenilurea könyvtár szűrésével állítottak elő, az IAP-ok célba juttatására fejlesztették ki (Schimmer és mtsai., 2004; Wang és mtsai., 2004). Ezenkívül a japán Ardisia gyógynövényből származó embelin nevű természetes terméket nemrégiben fedezték fel a XIAP sejtáteresztő, nempeptidikus, kis molekulatömegű gátlójaként egy hagyományos növényi gyógynövény háromdimenziós szerkezeti adatbázis szerkezetalapú számítógépes szűrése révén (Nikolovska-Coleska és mtsai., 2004). Kimutatták, hogy az embelin a XIAP BIR3 doménjéhez való kötődés révén hatékonyan legyőzi a XIAP védőhatását a magas endogén XIAP-szintű prosztataráksejtekben vagy XIAP-pal transzfektált Jurkat sejtekben (Nikolovska-Coleska és mtsai., 2004). Így a Smac agonisták vagy az alacsony molekulatömegű XIAP antagonisták ígéretes jelöltek lehetnek a rákterápiában, mivel szelektíven erősítik a citotoxikus terápiák hatékonyságát a rákos sejtekben.