Fluoreszcens fehérjék az A. victoriából
A GFP és változatainak spektrális tulajdonságai a kromofórt alkotó aminosavszerkezetben rejlenek (1. ábra). Ez lehet a 65-67. pozícióban lévő három aminosav vagy ehhez a helyhez közeli maradékok (pl. YFP). A kromofórt érintő fő mutációkon kívül más helyekre irányított mutageneziseket is végeztek a fehérje érésének és heterológ sejtrendszerekben történő kifejeződésének javítása érdekében (pl. kodonhasználat, a fehérje fiziológiás hőmérsékleten történő összecsukódása). Megjegyzendő, hogy az A. victoria egy viszonylag primitív tengeri organizmus, amely nem rendelkezik testhőrendszerrel.
Még ha a GFP az egyik legnépszerűbb FP is fényessége és nagyfokú fotostabilitása miatt, két fő hátránya van. Ezek a pH-ra való bizonyos érzékenység és a dimerizálódásra való enyhe hajlam. A dimerizáció vagy oligomerizáció számos FP problémája. Előszeretettel agglutinálódnak egymással, ami a fuzionált fehérje helyére és funkciójára vonatkozó leleteket vagy félreértelmezéseket eredményezhet. A tudósok azonban erre a problémára is találtak néhány választ. A kritikus pozíciók (F223R, L221K és A206K) mutációi, ahol a nem poláris aminosavakat hidrofil aminosavakra cserélik, csökkent dimerizációt mutatnak. Az összes olyan genetikai változtatást, amely a spektrális és a gyakorlati jellemzők javulásához vezet, “továbbfejlesztett” FP-k néven foglalják össze.
A wtGFP esetében a fejlesztések egy olyan EGFP-t (Enhanced GFP) eredményeznek, amely a korábbi 395 nm-es és 475 nm-es komplex abszorpciós spektrum helyett egyetlen 488 nm-es gerjesztési csúcsot mutat. A Roger Tsien és munkatársai által kifejlesztett wtGFP első mutáns változata (az S65T mutáns) ötször fényesebb volt az eredetinél, és rövidebb érési időt mutatott. Ez egy másik mutáción (F64L) alapuló, 37°C-on történő jobb érési hatékonysággal együtt fontos szerepet játszik az élő sejteket szemlélők számára.
Az egyik legnagyobb Stokes-eltolódással rendelkező, nagyon érdekes GFP-változat a Sapphire. A kromofórhoz közeli pozícióban bekövetkezett mutáció (T203I) a gerjesztési maximum 399 nm-re, az emissziós maximum pedig 511 nm-re változik. Ez 112 nm-es Stokes-eltolódást jelent. A smaragd egy másik GFP-módosítás, amely jobb fotostabilitással és fényerővel, valamint hatékonyabb hajtogatással rendelkezik emlőssejtekben.
Míg az összes zöld fluoreszcens fehérje viszonylag nagy fényerővel rendelkezik, a kék fluoreszcens fehérjék általában csökkent emissziós intenzitással küzdenek mikroszkópos alkalmazásokban. Ennek ellenére más spektrális tulajdonságaik miatt optikai vizsgálatokban használják őket. Az EBFP-t (Enhanced Blue Fluorescent Protein) a wtGFP többszöri mutációjával állították elő. Az első (Y66H) kihagyta az emissziós csúcsot a zöldből a kék spektrumba. Ezt további mutációk követték, amelyek egy olyan fehérjét hoztak létre, amelynek gerjesztési maximuma 380 nm-en, emissziós maximuma pedig 448 nm-en van. Ezek a spektrális tulajdonságok az EGFP partnerévé teszik a FRET-mikroszkópiában. Újabb, nagyobb kvantumhozammal és jobb fotostabilitással rendelkező kék fluoreszcens fehérjék az Azurit, az SBFP2 és az EBFP2. Az EBFP ígéretes utódja a Sirius nevű fehérje, amely azért vált népszerűvé, mert nagyon jól tűri a pH-t (pH 3-9 között stabil), és az eddigi legrövidebb emissziós hullámhosszú fluoreszcens fehérje hírében áll.
A GFP-változatok második “kék” osztályát a cian fluoreszcens fehérjék alkotják: CFP-k. A tirozin triptofánnal való helyettesítése (Y66W) és további genetikai módosítások jobb fényerősségű és fotostabilitású fluorokrómot eredményeznek. Ez az ECFP bimodális gerjesztési és emissziós spektrummal rendelkezik 433/445 nm-en és 475/503 nm-en. A fényerő az EGFP fényerejének csak mintegy 40 %-a. Az ECFP egyik kiemelkedő változata a Cerulean, amelynek magasabb az extinkciós együtthatója és a kvantumhozama. Az ECFP-nél 1,5-szer fényesebb, és az YFP-vel FRET-partnerként használják.
A kromofór három központi aminosavának egyikét közvetlenül nem módosító GFP-mutáció a sárga fluoreszcens fehérjék megjelenését eredményezte. Az YFP-knek van egy közös treoninjuk a 203-as pozícióban, amelyet tirozinra cseréltek (T203Y). Ez az aminosav a β-csatorna része, és a kromofór közvetlen közelében helyezkedik el. A GFP-hez képest a gerjesztési és emissziós tulajdonságok hosszabb hullámhosszra tolódtak el, a gerjesztési és emissziós maximumok 514 nm-nél és 527 nm-nél vannak (EYFP). Az EYFP egyik jellemzője a pH-érzékenység. pH 6,5-nél az EYFP fluoreszcenciájának csak mintegy 50 %-át mutatja, ami nem minden esetben hátrány. Ha pH-mérésről van szó (pl. vezikulák, endoszómák stb.), az EYFP indikátorként használható. Érdekes módon egy további mutáció (Q69M) jobb savstabilitást és drámaian jobb fényerőt (75%-kal fényesebb, mint az EGFP) eredményezett. Ezt a fehérjét, amely az EGFP-hez képest még mindig gyenge fotostabilitással rendelkezik, Citrine-nak nevezték el. Egy másik YFP mutáns (F46L) drasztikusan gyorsabb érési sebességet és jobb pH-állóságot mutatott. Ezt a fehérjét Venusnak neveztük el, és gyakori FRET-akceptor a Cerulean-nal.