Practice for Human Genetics Vienna

Genom-szerte mikroaberrációk keresése: Array-CGH

A kromoszómális anyag szaporodásán vagy csökkenésén alapuló komplex szindrómák már régóta ismertek. A 21-es triszómiában például egy teljes kromoszóma kétszer helyett háromszor van jelen. Az olyan mikrodeléciós szindrómákban, mint a Williams-Beuren-, a Prader-Willi- vagy a Smith-Magenis-szindróma, egy kromoszóma több vagy kevésbé meghatározott szakaszai hiányoznak, általában néhány megabázisnyi szubmikroszkopikus méretben. A monogenetikus betegségek esetében az utóbbi időben egyre gyakrabban fedezik fel egyes gének vagy génszakaszok delécióit vagy duplikációit a betegség okaként.

Az ilyen géndózis-változások diagnosztizálására eddig használt technikáknak megvannak a maguk korlátai: Például, bár a molekuláris citogenetikai módszerek, mint a FISH, vagy a molekuláris genetikai módszerek, mint az MLPA, nagy vagy legnagyobb felbontással használhatók, tudniuk kell, vagy eleve feltételezniük kell, hogy a genom mely területe érintett. Másrészt a klasszikus citogenetika vagy a CGH technika (“összehasonlító genomikus hibridizáció”: A beteg és a referencia DNS összehasonlító hibridizációja metafázisú kromoszómákon) képes lefedni a teljes genomot, de a felbontás a fénymikroszkóp használata miatt legfeljebb 5 Mb-ra korlátozódik.

A meglévő technikák ezen korlátainak leküzdésére a tömbi CGH megfelelő alternatíva.

A hagyományos CGH technikát itt a mikro-táblák segítségével végzett expressziós elemzés során szerzett tapasztalatokkal kombináljuk: Az üveglemez felületén immobilizált, meghatározott DNS-töredékek szolgálnak hibridizációs célpontként, ahol a “tömb” kifejezés e töredékek szabályos, rácsszerű elrendezésére utal. A fragmentumokat úgy választják ki, hogy a lehető legegyenletesebben fedjék le az emberi genomot.

Az elemzéshez a beteg DNS és a referencia genomi DNS közel azonos mennyiségét kohibridizálják a tömbön. Mivel a beteg és a referencia DNS-minták különböző fluoreszcens festékekkel vannak jelölve, a beteg genomjában bekövetkező számbeli változás a hibridizációs arány eltolódásán keresztül az egyes fragmentumok fluoreszcens jelének színeltolódásához vezet.

A array CGH technika sematikus ábrázolása:

a szkenner érzékeli a fluoreszcens jeleket és regisztrálja a színeltolódásokat. A megfelelő szoftverrel a jeleket a génterülethez rendelik, és végül az eredmény megjeleníthető, például “karyogram” formájában, amely megmutatja, hogy a kromoszóma melyik pontján vannak változások.

A tömbi CGH egyik eredményének megjelenítése: az Xp11-p21.1 régió duplikációja (a ZMG-ben a CGHAnalytics, Agilent segítségével készült)

A tömbi CGH felbontását a tömbön található fragmentumok száma és sűrűsége határozza meg. Jelenleg a teljes emberi genomot lefedő tömbök állnak rendelkezésre 1 Mb-tól kb. 35 kb-ig terjedő felbontással. A tömbönként folyamatosan növekvő fragmentumszám miatt a felbontás tovább fog nőni. Így az egyes gének kiegyensúlyozatlansága megbízhatóan kimutatható.

A tömbi CGH alkalmazásai

A tömbi CGH tehát egy olyan technika, amellyel a beteg teljes genomja nagy felbontással vizsgálható a normális géndózistól való eltérések szempontjából. Egyre fontosabbá válik, mint innovatív szűrési módszer, bár először elsősorban a tumordiagnosztikában alkalmazták. Ennek oka, hogy a tumor progresszióját az aberrációk felhalmozódása jellemzi, amely az onkogének amplifikációjával és a tumorszupresszor gének deléciójával járhat együtt.

Az arrayCGH különösen érdekes a megmagyarázhatatlan mentális retardáció eseteinek diagnosztikájában. A standard citogenetikában az aberrációk az esetek körülbelül 5%-ában láthatóak a mentális retardációval és a diszmorfia vagy a családi halmozódás további jeleivel rendelkező betegeknél. A szubtelomer-szűrés FISH vagy MLPA segítségével az esetek további 5%-ában találhat okot. A legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a körülbelül 1 Mb felbontású array CGH a betegek 10-15%-ánál fedez fel genomiális egyensúlyhiányt, ha a kariotípus nem szembetűnő és a szubtelomer leletek negatívak. (lásd a szakirodalmat). Feltételezzük, hogy ez az észlelési arány a tömbök felbontásának növekedésével nőni fog. Egyes kutatócsoportok már most is az array CH-t ajánlják első diagnosztikai lépésként a megmagyarázhatatlan mentális retardáció eseteiben.

Az array CH azonban nemcsak az új egyensúlytalanságokat mutatja ki, hanem a kromoszómarégiók citogenetikailag látható elvesztése vagy gyarapodása esetén a deléció méretének, a töréspontok helyének vagy a kiegészítő anyag eredetének pontos meghatározására is használható. Ez fontos a pontos genotípus-fenotípus korrelációhoz és az MR és a diszmorfia kialakulásában szerepet játszó jelölt gének azonosításához. Egyes kromoszóma-rendellenességeknél, amelyeket korábban “kiegyensúlyozott” transzlokációnak találtak, az array CGH kimutatta, hogy a töréspontok területén genetikai anyag deletálódott vagy duplikálódott, és így kiegyensúlyozatlan transzlokációról van szó. Így az array CGH segítségével a citogenetikai leletek pontosabbá és korrigáltabbá válnak.

Míg tehát a citogenetika és a molekuláris genetika közötti határok egyre inkább elmosódnak, a kariotipizálás továbbra is fontos marad, mivel bizonyos kromoszómaelváltozások array CGH-val nem mutathatók ki: Poliploidia, valódi kiegyensúlyozott transzlokációk és kis arányban aberráns sejteket tartalmazó mozaikos állapotok.

A teljes genomra vonatkozó magas kimutatási arány és az idő- és munkaigényes sejttenyésztés mellőzése miatt az array CGH új lehetőségeket nyit meg a prenatális diagnosztikában.

Az úttörő technika minden előnye és lehetősége mellett azonban nem szabad elfelejteni, hogy a kutatásból a diagnosztikába való átmenet itt még csak most történik meg. Az array CGH tehát nemcsak nyitott kérdéseket tisztáz, hanem az eredmények értelmezése új kérdéseket is felvethet:

A array CGH-vizsgálatok révén felfedezték, hogy az emberi genom váratlanul nagy arányban tartalmaz olyan régiókat, amelyek kópiaszáma a fenotípusosan normális emberekben is változik (lásd az irodalmat). Ezeknek a CNV-knek (“másolatszám-változások”) a mérete néhány kilobázistól több megabázisig terjed. Becslések szerint minden egyén legalább 3-11 ilyen variációt hordoz. Az ilyen polimorfizmusokat (azaz a fenotípust nyilvánvalóan nem befolyásoló mutációkat) tartalmazó adatbázisok csak most jönnek létre, ezért még nem teljesek. Ha most egy beteg DNS-ében az array CGH segítségével aberrációkat találnak, gyakran spekulatív, hogy ezek felelősek-e egyáltalán a fenotípusért. A legtöbb esetben a szülők DNS-ét is meg kell vizsgálni.

A valószínűsége annak, hogy egy kromoszómaaberráció betegséget okoz, növekszik

• az aberráció méretével
• ha “de novo” van jelen, a szülők nem hordozzák ezt az aberrációt
• ha az nem szerepel egyetlen polimorfizmus-adatbázisban sem
• ha olyan gének érintettek, amelyek kapcsolatba hozhatók a megfigyelt fenotípussal
• ha az azonos vagy hasonló aberrációval rendelkező esetek hasonló fenotípust mutatnak.

Minél több array CGH-t fognak használni a klinikai diagnosztikában, annál valószínűbb, hogy az array kialakítása alkalmazkodni fog a terület igényeihez: Az ismert CNV-régiók elkerülése, valamint a mentális retardációban és diszmorf szindrómákban szerepet játszó kromoszómarégiók és gének előnyben részesítése révén a tömbök egyre érdekesebbé válnak a születés előtti és utáni diagnosztika számára.

Intézetünk úgy alakította ki a pályát, hogy már most kihasználja a tömbtechnológia előnyeit, és azonnal fel tudja venni a jövőbeli fejlesztéseket. Olyan technikai berendezések mellett döntöttünk, amelyek a legnagyobb felbontású tömböket is megbízhatóan és reprodukálhatóan képesek kiértékelni.

Lépjen kapcsolatba velünk, ha szeretné igénybe venni szolgáltatásainkat és tapasztalatainkat a tömb CGH területén. Szívesen tájékoztatjuk Önt egy ilyen vizsgálat időtartamáról, a költségekről és a jelenleg használható array-kialakításokról.

Hivatkozások

Array CGH in mental retardation

Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP. A mikrocsíkon alapuló összehasonlító genomiális hibridizáció (array-CGH) szubmikroszkopikus kromoszóma-deléciókat és -duplikációkat mutat ki tanulási zavarral/mentális retardációval és diszmorfikus jellemzőkkel rendelkező betegeknél. J Med Genet. 2004 Apr;41(4):241-8.

de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA. Diagnosztikus genomprofilalkotás mentális retardációban. Am J Hum Genet. 2005 Oct;77(4):606-16.

Menten B, Maas N, Thienpont B, Buysse K, Vandesompele J, Melotte C, de Ravel T, Van Vooren S, Balikova I, Backx L, Janssens S, De Paepe A, De Moor B, Moreau Y, Marynen P, Fryns JP, Mortier G, Devriendt K, Speleman F, Vermeesch JR. Kriptikus kromoszóma-egyenetlenségek kialakuló mintái idiopátiás mentális retardációban és többszörös veleszületett anomáliákban szenvedő betegeknél: 140 betegből álló új sorozat és az irodalom áttekintése. J Med Genet. 2006.

Array-CGH in der Pränataldiagnostik

Rickman L, Fiegler H, Shaw-Smith C, Nash R, Cirigliano V, Voglino G, Ng BL, Scott C, Whittaker J, Adinolfi M, Carter NP, Bobrow M. Prenatal detection of unbalced chromosomal rearrangements by array-CGH. J Med Genet. 2006 Apr;43(4):353-61.

Van den Veyver, IB; Beaudet AL. Összehasonlító genomikus hibridizáció és prenatális diagnosztika. Curr Opin Obstet Gynecol 2006 (18): 185-191.

Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Strukturális variáció a humán genomban. Nat Rev Genet. 2006 Feb;7(2):85-97