A fixálás fontossága
A szövetek mikroszkópos vizsgálatához a szöveteket tartósítani (fixálni) kell, és elég vékony metszetekre kell vágni, hogy átlátszóak legyenek. A fixálás kritikus lépés a szövettani metszetek elkészítésében. Ha nem optimális körülmények között végezzük, vagy ha a fixálás késik, a szövetminta visszafordíthatatlanul károsodhat. Bármilyen nagy gondot fordítunk is a szövetfeldolgozás, a mikrotomia és a festés során, a mintából kinyerhető morfológiai és hisztokémiai információk sérülnek.
A szövetek rögzítésének általános célja, hogy a sejteket és szövetkomponenseket “életszerű állapotban” vagy az élő szövetet a lehető legkevésbé megváltoztatva őrizzük meg, mégpedig úgy, hogy vékony, festett metszetek készítését tegyük lehetővé. A fixálószer és a fixálási protokoll megválasztása függhet a további feldolgozási lépésektől és a tervezett végső elemzéstől. Nincs tökéletes fixálószer, bár a formaldehid áll hozzá a legközelebb. Ezért a jelen lévő szövet típusától és a bemutatni kívánt jellemzőktől függően többféle fixálószer áll rendelkezésre.
A fixálás típusa
A szövetek fixálása történhet kémiai vagy fizikai módszerekkel.
A fizikai módszerek közé tartozik a melegítés, a mikrohullámosítás és a kriokonzerválás (fagyasztva szárítás).
A kémiai fixálás általában úgy történik, hogy a mintát a fixálószerbe merítik (merítéses fixálás), vagy kis állatok vagy egyes egész szervek, például tüdő esetében az érrendszert fixálószerrel perfundálják (perfúziós fixálás). Egyes speciális hisztokémiai eljárásokhoz a fixálószereket esetenként gőz formájában is alkalmazzák. Például a paraformaldehid és az ozmiumtetroxid használható a fagyasztva szárított szövetek gőzfixálására.
- Tudjon meg többet a népszerű fixáló oldatokról
A fixálás mechanizmusa
A kémiai fixálás két fő mechanizmusa a keresztkötés és a koaguláció.
A keresztkötés során kovalens kötés jön létre mind a fehérjékben, mind a fehérjék között, melynek hatására a szövetek megmerevednek, és így ellenállnak a lebomlásnak.
A koagulációt a fehérjék dehidratálása okozza alkoholok vagy aceton alkalmazásával. Ezek a reagensek eltávolítják és kicserélik a szabad vizet a sejtekben és szövetekben, és a hidrofób kötések destabilizálásával változást okoznak a fehérjék tercier szerkezetében. Ezt denaturációnak is nevezik.
A rögzítést befolyásoló tényezők
- Hőmérséklet: Általánosságban elmondható, hogy a hőmérséklet emelkedése növelte a fixáció sebességét, de növelte az autolízis és a sejtelemek diffúziójának sebességét is. Hagyományosan a 0 és 4 °C közötti hőmérsékletet tekintették az ideális hőmérsékletnek vagy a minták rögzítésének. Ma már rutinszerűen szobahőmérsékleten végzik a rögzítést.
- Méret: 1-4 mm vastagság
- Térfogatarány: Legalább 15-20-szor nagyobb, mint a szövet térfogata
- Időtartam: 24-48 óra
- pH: A fiziológiás tartományban kell tartani, pH 4-9 között. Az ultrastruktúra megőrzéséhez a pH-t 7,2 és 7,4 között kell pufferelni.
Protokollok
- Módszerek és protokollok a csontanyag dekalcifikálására
- Standard protokoll a formalinnal fixált paraffinba ágyazott szövetekhez
Hasznos linkek
- A fixálás folyamata és az ún. A fixálószerek természete
- Népszerű fixáló oldatok
- A hisztológia alapjai
- National Society for Histotechnology
- A bevezetés a dekalcifikációba
- A Practical Guide to Good Histology Practice