Inmunoensayos basados en tiras
Puntos clave
- Simplicidad de uso
- Los resultados pueden estar disponibles en 15 minutos
- Bajo coste sin necesidad de Aunque los métodos rápidos han tenido un gran impacto en las pruebas microbiológicas durante los últimos veinte años, sólo unos pocos desarrollos pueden presumir de haber sido desarrollados por un grupo de expertos, sólo un puñado de desarrollos pueden afirmar que han sacado las pruebas del laboratorio. Uno de los que sí puede hacerlo, y que por ello se utiliza de forma generalizada, es la prueba de inmunoensayo de flujo lateral, también conocida como ensayo inmunocromatográfico o prueba en tira. Como muchas de las mejores ideas, los inmunoensayos de flujo lateral toman una tecnología inteligente y sofisticada y la convierten en algo tan sencillo de manejar que casi cualquiera puede utilizarla.
La tecnología La tecnología básica en la que se basan los inmunoensayos de flujo lateral se describió por primera vez en la década de 1960, pero la primera aplicación comercial fue la prueba de embarazo casera Clearview de Unipath, lanzada en 1988. Desde entonces, la misma tecnología se ha empleado para desarrollar una amplia y creciente gama de pruebas para aplicaciones clínicas, veterinarias, agrícolas, de la industria alimentaria, de defensa biológica y medioambientales.
Las pruebas en tira son extremadamente versátiles y están disponibles para una enorme gama de analitos, desde proteínas sanguíneas hasta micotoxinas y desde patógenos virales hasta toxinas bacterianas. Incluso se ha desarrollado un ensayo para que los productores de vino evalúen la cantidad de podredumbre de Botrytis en las uvas recién cosechadas.
Los inmunoensayos de flujo lateral son esencialmente inmunoensayos adaptados para operar a lo largo de un solo eje para adaptarse al formato de la tira de ensayo. Se han desarrollado diversas variaciones de la tecnología para convertirlas en productos comerciales, pero todas ellas funcionan según el mismo principio básico.
¿Cómo funciona un ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral?
Una tira reactiva típica consta de los siguientes componentes:
- Almohadilla de la muestra: una almohadilla absorbente sobre la que se aplica la muestra de la prueba
- Almohadilla de conjugado o reactivo: contiene anticuerpos específicos del analito objetivo conjugados con partículas coloreadas (normalmente partículas de oro coloidal, o microesferas de látex)
- Membrana de reacción – normalmente una membrana hidrofóbica de nitrocelulosa o acetato de celulosa en la que se inmovilizan anticuerpos contra el analito objetivo en una línea a través de la membrana como zona de captura o línea de prueba (también puede haber una zona de control, que contiene anticuerpos específicos para los anticuerpos conjugados)
- Mecha o depósito de residuos: otra almohadilla absorbente diseñada para arrastrar la muestra a través de la membrana de reacción por acción capilar y recogerla
Los componentes de la tira suelen estar fijados a un material de soporte inerte y pueden presentarse en un formato de varilla simple o dentro de una carcasa de plástico con un puerto de muestra y una ventana de reacción que muestra las zonas de captura y control.
Hay dos tipos principales de inmunoensayos de flujo lateral utilizados en las pruebas microbiológicas:
Asayos de sándwich de doble anticuerpo En este formato, la muestra migra desde la almohadilla de muestra a través de la almohadilla de conjugado, donde cualquier analito objetivo presente se unirá al conjugado. A continuación, la muestra sigue migrando a través de la membrana hasta llegar a la zona de captura, donde el complejo diana/conjugado se unirá a los anticuerpos inmovilizados produciendo una línea visible en la membrana. A continuación, la muestra sigue migrando a lo largo de la tira hasta llegar a la zona de control, donde el exceso de conjugado se unirá y producirá una segunda línea visible en la membrana. Esta línea de control indica que la muestra ha migrado a través de la membrana según lo previsto. Dos líneas claras en la membrana es un resultado positivo. Una sola línea en la zona de control es un resultado negativo. Los ensayos de sándwich de doble anticuerpo son los más adecuados para los analitos más grandes, como los patógenos bacterianos y los virus, con múltiples sitios antigénicos.
Ensayos competitivos Los ensayos competitivos se utilizan principalmente para analizar moléculas pequeñas y difieren del formato de sándwich de doble anticuerpo en que la almohadilla de conjugado contiene anticuerpos que ya están unidos al analito objetivo, o a un análogo del mismo. Si el analito objetivo está presente en la muestra, no se unirá al conjugado y permanecerá sin marcar. A medida que la muestra migra a lo largo de la membrana y llega a la zona de captura, un exceso de analito no marcado se unirá a los anticuerpos inmovilizados y bloqueará la captura del conjugado, de modo que no se producirá ninguna línea visible. El conjugado no unido se unirá entonces a los anticuerpos en la zona de control produciendo una línea de control visible. Una sola línea de control en la membrana es un resultado positivo. Dos líneas visibles en las zonas de captura y de control es un resultado negativo. Sin embargo, si no hay un exceso de analito objetivo no marcado, puede producirse una línea débil en la zona de captura, lo que indica un resultado no concluyente. Los ensayos competitivos son los más adecuados para analizar moléculas pequeñas, como las micotoxinas, incapaces de unirse a más de un anticuerpo simultáneamente. Existen diversas variaciones de la tecnología de flujo lateral. La zona de captura de la membrana puede contener antígenos o enzimas inmovilizados -dependiendo del analito objetivo- en lugar de anticuerpos. También es posible aplicar múltiples zonas de captura para crear una prueba multiplex. Por ejemplo, se han desarrollado tiras de prueba comerciales capaces de detectar las toxinas Shiga ST1 y ST2 de EHEC por separado en la misma muestra.
Los inmunoensayos de flujo lateral son sencillos de utilizar por operadores sin formación y generalmente producen un resultado en 15 minutos. Son muy estables y robustos, tienen una larga vida útil y no suelen requerir refrigeración. También son relativamente baratos de producir. Estas características los hacen ideales para su uso en el punto de atención y para analizar muestras en el campo, así como en el laboratorio. Sin embargo, su sensibilidad es limitada sin procedimientos adicionales de concentración o cultivo.
Pruebas cuantitativas Aunque la mayoría de los inmunoensayos de flujo lateral sólo son capaces de proporcionar un resultado cualitativo, es posible obtener cierto grado de cuantificación midiendo la cantidad de conjugado unido a la zona de captura. Esto puede hacerse utilizando un lector dedicado para medir la intensidad de la línea de prueba coloreada. Por ejemplo, Neogen Corporation ha desarrollado el lector de flujo lateral Accuscan™ para utilizarlo con su gama de kits de ensayo Reveal® y Charm Sciences también suministra un lector para su gama Rosa® de tiras de ensayo de micotoxinas. También se han desarrollado técnicas más sofisticadas, como los conjugados marcados con colorantes fluorescentes, para mejorar el potencial cuantitativo de los ensayos de flujo lateral. Aplicaciones En los 20 años transcurridos desde el lanzamiento de la primera prueba de flujo lateral, se ha desarrollado una enorme gama de pruebas diferentes basadas en la misma tecnología. Los primeros kits disponibles en el mercado estaban destinados al campo del diagnóstico clínico, pero ahora hay productos con aplicaciones en casi todas las ramas de la microbiología.
Microbiología clínica: se han desarrollado pruebas de flujo lateral para patógenos bacterianos, virus respiratorios y entéricos, parásitos intestinales y toxinas bacterianas. Muchos de los productos de inmunoensayo de flujo lateral diseñados para el sector clínico están destinados a ser utilizados en el punto de atención para el análisis directo de muestras fecales, de sangre y de orina, así como de hisopos nasales y de garganta, donde el funcionamiento sencillo y la rapidez de las pruebas son fundamentales para su uso fuera del laboratorio. Sin embargo, las mismas tiras reactivas también pueden ser útiles como prueba rápida de confirmación tras el cultivo en laboratorio de muestras clínicas.
Microbiología alimentaria y agrícola: existen tiras reactivas para patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos y toxinas bacterianas y fúngicas. En el sector de la microbiología alimentaria, es más probable que las principales aplicaciones sean en el laboratorio, aunque existen kits de pruebas de campo para micotoxinas en muestras de grano. Las pruebas para detectar patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos suelen implicar al menos una etapa de enriquecimiento antes de utilizar la tira de ensayo para confirmar la presencia o ausencia del patógeno. Algunos fabricantes, como Hygiena, han desarrollado medios y métodos de enriquecimiento específicamente diseñados para su uso con tiras de ensayo de flujo lateral. Las tiras de prueba también pueden ser útiles para la confirmación rápida de la identidad de los aislados bacterianos de las pruebas microbiológicas convencionales.
Microbiología del agua y del medio ambiente – ensayos limitados disponibles.
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