Conteggio delle cellule vitali
Ci sono una varietà di modi per enumerare il numero di batteri in un campione. Una conta delle cellule vitali permette di identificare il numero di cellule che crescono/si dividono attivamente in un campione. Il metodo di conteggio su piastra o piastra di diffusione si basa sui batteri che crescono una colonia su un mezzo nutritivo. La colonia diventa visibile a occhio nudo e il numero di colonie su una piastra può essere contato. Per essere efficace, la diluizione del campione originale deve essere organizzata in modo che in media crescano tra le 30 e le 300 colonie del batterio target. Meno di 30 colonie rendono l’interpretazione statisticamente insicura e più di 300 colonie spesso risultano in colonie sovrapposte e imprecisione nel conteggio. Per garantire che venga generato un numero appropriato di colonie, vengono normalmente coltivate diverse diluizioni. La procedura di laboratorio consiste nel fare diluizioni seriali del campione (1:10, 1:100, 1:1000 ecc.) in acqua sterile e coltivarle su agar nutriente in un piatto che viene sigillato e incubato. I mezzi tipici includono il Plate count agar per un conteggio generale o il MacConkey agar per contare i batteri gram-negativi come l’E. coli. Tipicamente una serie di piastre viene incubata a 22°C e per 24 ore e una seconda serie a 37°C per 24 ore. La composizione del nutriente di solito include reagenti che resistono alla crescita di organismi non bersaglio e rendono l’organismo bersaglio facilmente identificabile, spesso tramite un cambiamento di colore nel mezzo. Alcuni metodi recenti includono un agente fluorescente in modo che il conteggio delle colonie possa essere automatizzato. Alla fine del periodo di incubazione, le colonie vengono contate a occhio, una procedura che richiede pochi istanti e non richiede un microscopio in quanto le colonie sono tipicamente di pochi millimetri di diametro.
Il metodo della piastra di colata viene utilizzato quando l’analisi è alla ricerca di specie batteriche che crescono male in aria. L’analisi iniziale viene fatta mescolando diluizioni seriali del campione in agar nutriente liquido che viene poi versato in bottiglie. Le bottiglie sono poi sigillate e appoggiate sui loro lati per produrre una superficie di agar inclinata. Le colonie che si sviluppano nel corpo del mezzo possono essere contate a occhio dopo l’incubazione. Il numero totale di colonie è indicato come conteggio totale vitale (TVC). L’unità di misura è cfu/ml (o unità formanti colonie per millilitro) e si riferisce al campione originale. Il calcolo di questo è un multiplo del numero di colonie contate moltiplicato per la diluizione usata. Esempi di conteggio delle cellule vitali sono le piastre di diffusione da una diluizione seriale di una coltura liquida e le piastre di versamento. Con una piastra di diffusione si fanno diluizioni seriali in mezzi liquidi e poi si sparge un volume noto dall’ultima provetta della serie di diluizioni. Le colonie sulla piastra possono essere contate e si può calcolare la concentrazione di batteri nella coltura originale. Nel metodo della piastra di coltura, un campione batterico diluito viene mescolato con agar fuso e poi questa miscela viene versata in una piastra di Petri. Anche in questo caso si contano le colonie e si calcola la conta delle cellule vitali.