Analisi e descrizione delle fasi di formazione del biofilm di Aspergillus fumigatus mediante microscopia elettronica a scansione

Dal punto di vista medico, Aspergillus fumigatus è un patogeno opportunista di individui immunocompromessi, con una gravità di malattia che dipende dallo stato immunitario dell’ospite, dimostrando un tasso di mortalità del 50-95%. Questo fungo dà origine a infezioni locali, come le dermatomicosi delle unghie o le cheratiti fungine, e a infezioni invasive, come l’aspergillosi, e costituisce la seconda causa più comune di infezioni fungine nei pazienti ospedalizzati. L’infezione da A. fumigatus nell’apparato respiratorio può causare la palla fungina polmonare, l’aspergillosi invasiva, l’aspergillosi polmonare invasiva (IPA), la polmonite da ipersensibilità, l’asma, la rinite allergica mediata dall’immunoglobulina E, la polmonite cronica necrotizzante o l’aspergillosi broncopolmonare allergica (ABPA). Inoltre, dà luogo a osteomielite ed endocardite.

A. fumigatus sviluppa un biofilm che può essere uno dei più importanti fattori di virulenza. Il biofilm di A. fumigatus elabora miceli incorporati in un EMC in vitro, e la formazione di biofilm è stata descritta in cellule epiteliali bronchiali umane (HBE) e cellule epiteliali bronchiali della fibrosi cistica (CFBECs) e in pazienti con fibrosi cistica. La formazione di biofilm di funghi su cateteri e protesi contribuisce allo sviluppo di infezioni nosocomiali. Pertanto, la persistenza delle infezioni fungine si verifica a causa della capacità di un fungo di formare biofilm su una grande varietà di dispositivi medici e perché le cellule persistenti rappresentano un importante meccanismo di resistenza. La terapia sottoposta a un biofilm stabilito nell’ospite di solito richiede la somministrazione di concentrazioni tossiche di antimicrobici, e il trattamento raccomandato include la rimozione del dispositivo contaminato; tuttavia, questo è un processo difficile e costoso. Pertanto, i biofilm fungini sono un importante problema clinico ed economico.

Nell’ultimo decennio, sono stati pubblicati diversi studi sul biofilm di A. fumigatus, sia in vivo (in modelli murini, in pazienti con aspergillosi polmonare invasiva e in colture epiteliali umane primarie) che in vitro (su piastre di polistirene). In generale, questi studi riguardano principalmente lo stadio di maturità del biofilm e la composizione chimica dell’ECM, con poche immagini delle fasi del biofilm, ma ognuno di questi ha descritto tutte le fasi della formazione del biofilm. Così, le informazioni sono diverse dai contributi fatti dal nostro gruppo di lavoro.

I contributi più importanti di questo studio sono i seguenti: i) forniamo una descrizione di ogni fase della formazione del biofilm di A. fumigatus in vitro, nel tempo, e le fasi sono supportate da immagini SEM; ii) abbiamo analizzato due diverse origini di isolati: una dall’ambiente e una da un paziente con ulcera corneale; iii) riportiamo micro-hyphae (isolato clinico) e strutture fungine che sono state scarsamente riportate fino ad oggi e che non sono state descritte, a nostra conoscenza, per la specie Aspergillus; e iv) forniamo una descrizione della fase di dispersione per la formazione della colonizzazione del biofilm in nuovi punti.

Per analizzare l’organizzazione strutturale del biofilm maturo di A. fumigatus (24 ore di incubazione a 28 °C e 37 °C), due ceppi, uno dal suolo e un altro da un paziente con cheratite fungina, sono stati esaminati al SEM. Una panoramica della formazione di biofilm di A. fumigatus osservata in questa ricerca è stata che questi biofilm si sono comportati in modo simile indipendentemente dal fatto che l’isolato provenisse dal suolo o dalla clinica; tuttavia, le differenze si sono presentate in base alla temperatura di incubazione. A 28 °C, il biofilm ha mostrato fasi simili a quelle descritte nella crescita microbica classica: le fasi lag, esponenziale e stazionaria; la crescita del biofilm era lenta e stabile con una bassa produzione di ECM, e l’organizzazione strutturale fungina era semplice (Fig. 1). A 37 °C, la curva delle prestazioni ha mostrato una fase lag (di adattamento) e log (esponenziale) abbastanza variabile, che potrebbe essere in risposta allo stress dovuto all’incubazione a una temperatura elevata; quindi, a 37 °C c’è una riduzione della fase di adattamento (lag) per mantenere il fungo vitale; inoltre, la fase log, con un aumento discontinuo e con entrambi i comportamenti è probabilmente una risposta adattativa. Così, a 37 °C durante la fase di maturazione, c’erano strutture miceliche estremamente organizzate, e queste erano ridotte e compattate con ife che erano ispessite e fuse in anastomosi, e l’ECM era abbondante nel suo rivestimento, circondando e rafforzando le strutture fungine (Figg. 3 e 4).

In questo studio, forniamo prove delle fasi del biofilm di A. fumigatus al SEM. Le fasi osservate durante la formazione del biofilm sono state le seguenti:

Aderenza, co-aggregazione cellulare e produzione di EPS

In una fase iniziale (Fig. 2/4 h), i conidi aderiscono alla superficie della piastra attraverso un’interazione di forze elettrostatiche tra i componenti strutturali della parete cellulare del fungo, e questa forza di attrazione è debole e, quindi, reversibile. Il legame irreversibile e permanente è stato ampiamente descritto in specifiche adesine batteriche presenti sulla superficie cellulare, che si legano al substrato e all’EPS, che sono sostanze prodotte dal microrganismo nelle fasi iniziali della formazione del biofilm che funzionano nell’adesione delle cellule tra loro e al substrato e sono composte da complessi proteico-carboidrati e glicoproteine che svolgono principalmente funzioni strutturali o adesive. Le adesine sono coinvolte nel riconoscimento delle cellule batteriche tra di loro, compresa la costruzione di ponti e l’avvio della formazione di colonie. Le adesine sono descritte nell’adesione dei funghi durante la formazione di biofilm. Nei biofilm di Candida albicans, Candida glabrata e Candida tropicalis, c’è un gruppo di geni di adesione coinvolti nella formazione del biofilm che appartengono alla famiglia agglutinin-like sequence (ALS), che gioca un ruolo chiave in questo processo e codifica proteine che possiedono le caratteristiche delle glicoproteine adesine sulla superficie cellulare. La famiglia ALS presente in C. albicans comprende otto geni (ALS1-ALS7 e ALS9) che codificano molte glicoproteine di superficie. In A. fumigatus, sono state identificate sei idrofobine, che comprendono i rodlets RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp e RodFp, sulla superficie dei conidi. Questa caratteristica idrofobica permette l’adesione alle proteine delle cellule ospiti, e potrebbero essere coinvolte nell’adesione alla superficie della piastra di polistirolo e nell’avvio del processo di formazione del biofilm in tutti o solo in due o tre di questi. Inoltre, Gravelat e collaboratori hanno descritto questa interazione fungina, e hanno trovato che l’adesina MedA controlla l’adesione alla piastra di polistirene, la formazione di biofilm, e l’espressione dei geni di conidazione e che ha effetti difficili sul processo di conidiazione in A. fumigatus . L’adesione, risultante dall’interazione tra le adesine fungine e la superficie della piastra, e l’adesione conidio-conidio probabilmente innesca la segnalazione e promuove la co-aggregazione cellulare e la produzione di EPS, e questi eventi sono presentati in Fig. 2 (4 h). Allo stesso tempo, l’EPS accelera la formazione della colonia fungina attraverso lo stretto legame delle cellule (Fig. 2 (8-12 h)) .

Germinazione delle conidi in ife e sviluppo

La formazione del biofilm richiede un numero soglia di cellule per consentire loro di essere percepite e generare una risposta, che è un meccanismo di regolazione dell’espressione genica con funzioni specifiche . Nella formazione del biofilm di A. fumigatus, prima di iniziare la germinazione dei conidi, la superficie dei conidi è marcatamente idrofoba ed è composta per il 40% da gruppi metilici idrofobici. La germinazione dei conidi di A. fumigatus porta alla rottura dello strato idrofobico proteico-rodlet e rivela le pareti interne del conidio che sono essenzialmente composte da polisaccaridi, che sono componenti idrofili della parete cellulare. C’è una punta idrofoba su una singola spora in germinazione. Il conidio perde progressivamente la sua idrofobicità superficiale e, in seguito, il nuovo punto di crescita mostra una coesistenza di rodlets idrofobici e polisaccaridi idrofili. La germinazione conidiale in ife inizia con la formazione di tubi germinali, come illustrato in Fig. 2 (8-12 h), che possiedono la natura molto idrofila della parete cellulare, e ci si aspetta che favoriscano la crescita ifale.

Maturazione del biofilm

La maturazione del biofilm di A. fumigatus è stata osservata a 24 h, che è un tempo di incubazione simile a quelli riportati da altri ricercatori. I componenti strutturali includono l’ECM, che è presente nel biofilm maturo e lega le cellule per formare la base strutturale del biofilm, compresi l’EPS e molti miceli organizzati (Fig. 2 (24 h0) . ECM. L’acqua è il componente più abbondante e, nel biofilm, è quasi il 97%. In questo ambiente umido, c’è una rete macromolecolare ordinata. Le principali funzioni descritte per l’EPS nei biofilm batterici sono le seguenti: adesione, aggregazione cellulare, coesione; ritenzione idrica, una barriera protettiva come difese specifiche dell’ospite o agenti antimicrobici, assorbimento di composti organici e ioni inorganici, attività enzimatica, fonte di nutrimento, scambio di informazioni genetiche, donatore o accettore di elettroni, esportazione di componenti cellulari, stoccaggio di ritenzione di energia in eccesso, e la stabilizzazione degli enzimi. Nei biofilm fungini, tutte queste funzioni non sono ancora descritte, ma alcune di esse sono in fase di studio: le forze coesive e adesive della matrice contribuiscono alla stabilità architettonica e meccanica del biofilm. Le cellule fungine sono immobilizzate nella matrice e agiscono come un ecosistema funzionante in continua evoluzione e regolazione omeostatica con intense interazioni, compresa la comunicazione cellula-cellula, che agisce come la colla che tiene insieme le cellule. La struttura del biofilm varia notevolmente a seconda del microrganismo che lo produce e delle condizioni che circondano i suoi microhabitat, comprese le differenze strutturali associate alla presentazione clinica. Durante i processi infettivi, l’ECM supporta la protezione contro l’ospite, così come la resistenza ai farmaci da parte dei microrganismi; quindi, l’ECM non è solo una struttura meccanica, ma è anche un regolatore del comportamento cellulare. Le proteine idrofobiche della matrice si legano con i recettori specifici della superficie cellulare che portano all’adesione cellula-matrice, che esercita un effetto sulla forma delle cellule, la migrazione, la proliferazione, la sopravvivenza cellulare e il metabolismo. Inoltre, l’ECM protegge le cellule dagli insulti ambientali, tra cui l’essiccazione, gli ultravioletti (UV), le radiazioni, l’ossidazione, la fame, l’azione dei predatori e le difese immunitarie dell’ospite e gli antibiotici. Le caratteristiche dell’ECM erano evidenti nella Fig. 2 (24 h) e nella Fig. 3 e aderivano alle ife fungine in una guaina contigua ed erano anche osservate con una consistenza porosa (Fig. 2 (24 h)). Nel biofilm di A. fumigatus, l’EPS era altamente strutturato e aveva una produzione abbondante, che copriva, circondava e rafforzava le strutture fungine; agisce come coesivo per la fusione delle strutture ife-tife (solo 37 °C). L’EPS si presenta con un aspetto mucoso che aderisce completamente e copre le ife, causando anastomosi e chiude il lume dei canali d’acqua (Figg. 2 (24 h), 3, e 4). In studi precedenti, il nostro gruppo di lavoro ha descritto la fase di maturazione del biofilm di A. fumigatus, in cui sono state osservate strutture simili.

In alcuni micro-consorzi, la composizione chimica dell’EPS è nota (polimeri di carboidrati, DNA e/o proteine e, lipidi, tra gli altri) ma altri rimangono da identificare. La superficie di A. fumigatus è composta da α-1,3-glucani, chitina, chitosano, galattomannano, galattosaminogalattano, melanina e proteine. La composizione e l’organizzazione strutturale della parete cellulare è costantemente rimescolata; anche se i polisaccaridi presenti sono gli stessi, la loro quantità e localizzazione variano con le condizioni di crescita e l’ambiente nutrizionale. Qui, abbiamo mostrato la composizione chimica del biofilm di A. fumigatus, che è stata osservata dalla co-localizzazione dei fluorocromi attaccati alla chitina, all’attività metabolica e agli acidi nucleici tramite CLSM; inoltre, la sovrapposizione dei segnali fluorocromatici è stata osservata quando questi attaccavano due o tre di questi (Fig. 5). La funzione descritta per i polisaccaridi, come gli α 1,3-glucani, comprendeva il loro ruolo predominante in vitro nell’aggregazione ifale e nell’aggregazione ifale nei biofilm. Altri polisaccaridi dell’ECM, tra cui il galattomannano e il galattosaminogalattano sono anche noti per avere un ruolo nella protezione del fungo, e nell’adesione delle sue strutture di biofilm alle superfici. Il DNA extracellulare (eDNA) è una componente importante del biofilm ECM che mantiene l’integrità strutturale e architettonica di A. fumigatus. L’eDNA è creato dall’autolisi ed è stato significativamente associato ai livelli di resistenza antifungina (Fig. 5). Inoltre, l’eDNA può essere un serbatoio di geni per il trasferimento genico orizzontale. Il DNA conferisce un’organizzazione strutturale più solida e resistente quando è co-localizzato con i polisaccaridi. L’eDNA deriva dalle cellule fungine grazie alla secrezione di chitinasi da parte di A. fumigatus che ne favorisce il rilascio (Fig. 5) . Nel biofilm, la modificazione della parete cellulare esercita un impatto essenziale sulla resistenza ai farmaci della parete cellulare. In A. fumigatus, in un modello di biofilm di topo, in multidrug-resistant (MDR) pompe di efflusso AfuMDR4 geni associati con l’uscita di antimicrobici, il gene è stato significativamente indotto dal trattamento con Voriconazolo dopo 24 h . Il marcatore FUN1 ha rivelato un’attività metabolica che è una comunità vivente (Fig. 5).

Miceli: Il biofilm mostra una complessa struttura tridimensionale (3-D) che riflette un processo cellulare coordinato; lo sviluppo e l’espansione miceliale erano evidenti, che comprendeva reti compattate di stratificazione ifale, l’adesione ifa-alfa, anastomosi ad entrambe le temperature, con ottimale spaziale-disposizione-formato canali per fornire afflusso di nutrienti e efflusso di prodotti di scarto e quindi stabilizza il biofilm; a 37 ° C, questo canale era più evidente (Figs. 2 (24 h), 3 e 4). Inoltre, queste strutture sono state osservate da altri ricercatori. Microfiori: Nelle prime fasi di maturazione del biofilm, nell’isolato clinico sono state osservate strutture fungine irregolari, come le micro ife (Fig. 4). Questo fatto è rilevante perché ci sono pochi riferimenti alle microyphae nella letteratura, e questa è la prima volta che sono state descritte in A. fumigatus. Le micro ife presentano alterazioni del citoscheletro che generano ife corte e sottili con pareti sottili e con estremità piegate. Le micro ife sono associate a un’elevata attività enzimatica che favorisce il processo di maturazione e la successiva dispersione delle cellule nello stadio di biofilm.

Dispersione delle cellule

Durante la dispersione delle cellule, una parte del biofilm si stacca, la parte che comprende i conidi o le ife. È stato osservato uno sviluppo asincrono del biofilm, soprattutto nella fase di maturazione del biofilm, quando i nuovi conidi erano in grado di germinare, producendo una nuova crescita miceliale e modifiche ifali, come i riccioli (Figg. 4 e 6). La dispersione cellulare del biofilm avviene in risposta ai cambiamenti ambientali. Questo agisce per rimuovere una sostanza pericolosa dal corpo principale del biofilm. Questo processo porta alla diffusione e alla propagazione delle cellule del biofilm in una nuova posizione, che è sostenuta da eventi molecolari complessi. I biofilm possono essere visti come gusci protettivi delle cellule viventi sottostanti, con funzioni estremamente complesse e innumerevoli, e quindi sono costruzioni biologiche davvero notevoli. I biofilm forniscono protezione contro la predazione o l’attacco chimico e forniscono alle cellule interne un mezzo per la comunicazione intracellulare, il flusso di nutrienti e il trasferimento di materiale genetico. La dispersione cellulare diffonde le cellule vitali in altri luoghi nell’ambiente o all’interno di un ospite dove le cellule possono riprodursi, facilitando così la sua persistenza. La dispersione cellulare si verifica come risultato di scarse condizioni ambientali di nutrimento, e quindi è un meccanismo di sopravvivenza. Pertanto, la dispersione cellulare è importante non solo per promuovere la diversità genetica, ma anche per sfuggire ad habitat sfavorevoli, aiutando lo sviluppo di nuove nicchie e la persistenza del microrganismo in una nuova posizione.